Diagnostyka fotodynamiczna i autofluorescencyjna nowotworów

mierze pozwalają na wczesne ustalenie rozpoznania, nawet we wczesnym stadium zaawansowania nowotworu, a włączenie właściwych działań terapeutycznych pozwala na całkowite wyleczenie wielu chorych. Działania specjalistów są obecnie ukierunkowane zwłaszcza na poszukiwanie wczesnych postaci nowotworów, ale również wykrywanie zmian, które w przyszłości mogą transformować w kierunku procesu nowotworowego. Mnogość uzupełniających się metod obrazowania pozwala na stosunkowo wczesne rozpoznawanie chorób nowotworowych i zastosowanie optymalnego postępowania terapeutycznego.

Równie istotne wydaje się poszukiwanie metod diagnostycznych minimalnie inwazyjnych, jak najmniej obarczających ryzykiem wystąpienia powikłań, a jednocześnie cechujących się jak największą czułością i swoistością. Szczególne trudności sprawia obecnie diagnostyka niewielkich zmian, które makroskopowo trudno odróżnić od tkanek fizjologicznych, a także zmian wieloogniskowych i rozproszonych wśród tkanek prawidłowych.

Rozwój technik obrazowania tkanek dokonany w ciągu ostatnich 50 lat pozwolił na istotne zwiększenie możliwości rozpoznawania wielu schorzeń nowotworowych. Dynamiczny rozwój technik cyfrowych obrazowania oraz światłowodowych systemów przesyłania obrazu udoskonalił endoskopowe metody obrazowania tkanek, przyczyniając się do znacznego rozszerzania możliwości diagnostycznych w takich specjalnościach zabiegowych, jak ginekologia i urologia, a także w specjalnościach z zakresu chorób wewnętrznych – np. pulmonologii lub gastroenterologii.

Zastosowanie metod autofluorescencyjnych i fotodynamicznych

W codziennej praktyce klinicznej diagnostyka autofluorescencyjna i fotodynamiczna realizuje się na pięciu poziomach diagnostycznych.

Są nimi:

• diagnostyka wczesnych postaci nowotworów – może to być zatem metoda wykorzystywana w zapobieganiu dalszej transformacji nowotworowej
• ocena zmian przednowotworowych, które w przyszłości mogą dać początek transformacji nowotworowej
• zapobieganie nawrotom choroby, zwłaszcza wtedy, gdy w badaniach tradycyjnych nie uwidoczniono ewidentnych cech progresji lub nawrotu nowotworu
• możliwość monitorowania przebiegu choroby nowotworowej i wyniku zastosowanych działań terapeutycznych, głównie leczenia chirurgicznego oraz terapii fotodynamicznej
• możliwość wykluczenia nowotworowego charakteru zmiany.

W piśmiennictwie podkreśla się, iż na wyzwania diagnostyczne i terapeutyczne stawiane przez współczesną onkologię zdają się w dużej mierze odpowiadać fluorescencyjne techniki obrazowania tkanek, a wśród nich diagnostyka autofluorescencyjna, fotodynamiczna oraz biopsja optyczna.

Diagnostyka fotodynamiczna i autofluorescencyjna

Diagnostyka autofluorescencyjna jest metodą obrazowania wykorzystywaną od około dekady jako uzupełnienie tradycyjnego badania endoskopowego. Opiera się ona na naturalnym zjawisku emisji światła z tkanek po wzbudzeniu zawartych w nich endogennych związków o budowie porfirynowej. U podstaw fizycznych i biologicznych tej metody leży gromadzenie się substancji porfirynowych w większych stężeniach w tkankach charakteryzujących się szybszym metabolizmem oraz szybszym wzrostem w porównaniu z tkankami fizjologicznymi. Na różnicowanie, oparte na właściwościach biooptycznych tkanek zdrowych i nowotworowych, ma znaczący wpływ zachwianie równowagi oksydoredukcyjnej w komórkach nowotworowych, która przejawia się zmianą stosunku utlenionych do zredukowanych NAD i FAD. W piśmiennictwie podkreśla się, iż poza wymienionymi czynnikami pozwalającymi na odróżnienie tkanki nowotworowej od tkanki fizjologicznej, analiza zjawiska autofluorescencji umożliwia wykazanie różnic architektoniki tkanek zdrowych i nowotworowych. Wieloetapowy proces transformacji tkanek w kierunku nowotworowym prowadzi do zaburzenia właściwej dla danej tkanki struktury komórkowej oraz naczyniowej, a tym samym do manifestacji tego zjawiska w postaci istotnych różnic w emitowanym widmie światła pochodzącym z tkanki badanej.

Zjawisko autofluorescencji tkanek zachodzi po doprowadzeniu do badanego obszaru tkankowego energii świetlnej o ściśle określonych długościach fal, odpowiadających pasmom pochłaniania wybranych endogennych substancji optycznie czynnych o właściwościach autofluorescencyjnych.

Podkreśla się, że zmiany takich zjawisk fizycznych, jak rozpraszanie, odbicie oraz absorpcja fal światła ultrafioletowego i widzialnego, są podstawą optycznej analizy tkanek, umożliwiają też precyzyjne określenie marginesu tkanki zdrowej i patologicznej. W wyniku tych procesów obserwuje się istotne zmniejszenie natężenia zielonej fizjologicznej autofluorescencji w obrębie tkanki nowotworowej w porównaniu ze znacznym natężeniem zielonej autofluorescencji emitowanej z tkanek zdrowych.

Pierwsze doniesienia poświęcone wykorzystaniu tej metody pojawiły się w latach 90. XX wieku, gdy udowodniono przydatność obrazowania fotodynamicznego i zasadność jego stosowania w diagnostyce wczesnych postaci nowotworów oraz stanów przednowotworowych w uzupełnieniu dotychczasowych metod obrazowania endoskopowego.

Dzięki intensywnym badaniom poświęconym opracowaniu nowoczesnych systemów komputerowych oraz optycznych wykorzystywanych we współczesnym obrazowaniu endoskopowym, możliwe było stworzenie integralnych systemów obrazowania dwumodalnego, pozwalającego na ocenę zarówno w świetle białym, jak i fluorescencyjnym, w trakcie tej samej procedury.

W ostatnim dziesięcioleciu na podstawie wyników badań nad wykorzystaniem autofluorescencji w diagnostyce schorzeń nowotworowych obrazowanie autofluorescencyjne skutecznie wprowadzono do codziennej praktyki klinicznej w wielu ośrodkach na świecie. Metoda ta służy obrazowaniu wczesnych i zaawansowanych postaci raka drzewa oskrzelowego, ocenie zmian polipowatych jelita grubego, diagnostyce czerniaka skóry, zmian powierzchownych błony śluzowej pęcherza moczowego, często również jest stosowana jako badanie przesiewowe.

Najczęściej wykorzystywanymi w obrazowaniu autofluorescencyjnym źródłami światła wzbudzania są lasery, które pozwalają na uzyskanie konkretnej długości fali światła spolaryzowanego o ściśle dobranych energiach. W praktyce klinicznej znalazły zastosowanie jonowe lasery kryptonowe i argonowe, lasery barwnikowe, a także lasery diodowe, dzięki którym uzyskano istotne zmniejszenie kosztów aparaturowych oraz znaczne wydłużenie żywotności źródeł światła. Postęp w optyce źródeł światła endoskopowego, wprowadzenie światłowodów do transmisji sygnału optycznego oraz zastosowanie systemów wideoendoskopii pozwoliły na wykorzystanie lampowych źródeł światła, przy czym uzyskiwanie monochromatycznego światła wzbudzania zachodzi tutaj przez system filtrów optycznych selekcjonujących, dzięki czemu możliwe jest jednoczesne badanie zarówno w tradycyjny sposób w świetle białym, jak i w świetle autofluorescencyjnym.

Stosowana na obecnym rynku medycznym aparatura do diagnostyki autofluorescencyjnej obejmuje widmo pochodzące z obserwowanych tkanek reprezentowane przez trzy podstawowe składowe kolorowe obrazu. Przekłada się to na uzyskanie w czasie rzeczywistym obrazu kolorowego zmiany o charakterze nowotworowym na tle tkanek niezmienionych. W wyniku odpowiednich transformacji obrazu możliwe jest jednoczesne obrazowanie tkanek patologicznych na tle tkanek fizjologicznych, co znacznie usprawniło interpretację uzyskiwanych wyników. Zsynchronizowanie kamer autofluorescencyjnych oraz fluorescencyjnych z optyką endoskopową pozwoliło na rozszerzenie aplikacji tych metod obrazowania na narządy dostępne endoskopowo, tym samym usprawniając diagnostykę zmian nowotworowych oraz istotnie poprawiając czułość i swoistość tradycyjnej endoskopii.

Cennym udoskonaleniem obrazowania autofluorescencyjnego stały się możliwości jednoczasowego z obrazowaniem analizowania uzyskiwanych obrazów autofluorescencyjnych. Obraz pochodzący z kamer autofluorescencyjnych jest w czasie rzeczywistym rozkładany na poszczególne składowe, które następnie są analizowane osobno po jednym kliknięciu przycisku aparatu, co z kolei znakomicie usprawnia i przyspiesza decyzję i wybór miejsca pobrania wycinków do badania histopatologicznego. Kolejnym istotnym udoskonaleniem obrazowania autofluorescencyjnego było stworzenie algorytmów analizy obrazu pozwalających na uzyskiwanie przestrzennych map natężenia światła emitowanego z tkanek, dzięki czemu ustalono, iż w miejscach o największym zaawansowaniu procesu nowotworowego dochodzi do znacznego zmniejszenia natężenia światła o długościach z zakresu koloru zielonego w porównaniu z tkankami zdrowymi. Przestrzenne mapy natężenia autofluorescencji istotnie poprawiły skuteczność biopsji wykonywanych w celu pobrania wycinków tkankowych do badań histopatologicznych w porównaniu z tradycyjnym obrazowaniem opartym na emisji fluorescencji oraz z tradycyjnym obrazowaniem endoskopowym w świetle białym. Rozszerzenie obrazowania autofluorescencyjnego o przekształcenia przestrzenne natężenia autofluorescencji istotnie zmniejszyło również odsetek uzyskiwanych wyników fałszywie ujemnych.

Kliniczne zastosowania diagnostyki autofluorescencyjnej i fotodynamicznej

Zastosowanie w dermatologii

W praktyce klinicznej diagnostyka autofluorescencyjna i fluorescencyjna znalazła szerokie zastosowanie w dermatologii – zarówno w rozpoznawaniu zmian nowotworowych i przednowotworowych skóry, jak i w ocenie skuteczności zastosowanego leczenia oraz w dalszym monitorowaniu chorych. Metoda okazała się szczególnie przydatna w  ocenie klinicznie podejrzanych zmian skórnych, zmian przednowotworowych oraz wczesnych zmian nowotworowych, zwłaszcza mnogich. Pozwala na weryfikację zmian i określenie stopnia ich wysycenia substancjami fotouczulającymi jako przygotowania do ewentualnej terapii fotodynamicznej. W piśmiennictwie podkreśla się wyjątkową przydatność diagnostyki fluorescencyjnej w ocenie zmian o podejrzanym charakterze, zwłaszcza zakwalifikowanych do leczenia paliatywnego lub umiejscowionych w okolicach narządów zmysłów oraz narządów ważnych dla życia. Wyniki przeprowadzonych badań klinicznych świadczą o wybitnej skuteczności tych nieinwazyjnych metod w diagnostyce oraz kontroli, zastosowanym leczeniu, również fotodynamicznym, a także w ocenie radykalności leczenia chirurgicznego i radioterapii.

Zastosowanie w pulmonologii

W przeprowadzonych dotychczas badaniach klinicznych w zakresie pulmonologii udowodniono znaczną skuteczność fluorescencyjnych metod obrazowania w diagnostyce zmian o charakterze nowotworowym, zwłaszcza w przypadkach wątpliwych, w których tradycyjne metody diagnostyczne nie pozwalają na ustalenie jednoznacznego rozpoznania. Szczególnie intensywne są badania nad udoskonalaniem metod ujawniających zmiany przednowotworowe i wczesne postacie nowotworów.

Wyodrębniono szereg sytuacji klinicznych, w których obrazowanie autofluorescencyjne może przynosić określone korzyści diagnostyczne. Należy do nich diagnostyka chorych z objawami klinicznymi zdecydowanie sugerującymi raka odoskrzelowego płuca, u których w badaniu cytologicznym plwociny wykryto komórki nowotworowe, natomiast obraz radiologiczny klatki piersiowej ani bronchoskopia wykonywana w świetle białym nie wykazały nieprawidłowości. Ocenie autofluorescencyjnej powinni być też poddani chorzy z objawami klinicznymi zdecydowanie sugerującymi raka odoskrzelowego płuca, bez zmian w badaniu radiologicznym klatki piersiowej, z ujemnym wynikiem badania cytologicznego plwociny oraz prawidłowym wynikiem bronchoskopii w świetle białym. Kolejna grupa to chorzy bez objawów klinicznych, ale z podejrzanym obrazem radiologicznym i (lub) bronchoskopowym oraz ujemnym wynikiem badania cytologicznego plwociny w kierunku komórek nowotworowych.

Diagnostykę autofluorescencyjną i fluorescencyjną można też wykorzystać w celu dodatkowej oceny stopnia zaawansowania rozpoznanego raka odoskrzelowego płuca zakwalifikowanych do leczenia chirurgicznego, we wspomaganiu nieinwazyjnej kontroli po lobektomii lub pulmonektomii z powodu raka płuca, rozpoznawaniu wznowy po operacji, a także wówczas, gdy konieczna jest ocena patomorfologiczna błony śluzowej dróg oddechowych.

Zastosowanie w gastroenterologii

Diagnostyka fluorescencyjna i autofluorescencyjna znalazła szerokie zastosowanie w gastroenterologii. Pojawia się coraz więcej nowych koncepcji dotyczących potencjalnego wykorzystania tych metod obrazowania endoskopowego celem poprawy trafności pobierania wycinków drogą biopsji.

Badania kliniczne prowadzone w ośrodkach endoskopowych w Polsce i na świecie dowiodły znaczącej skuteczności oceny autofluorescencyjnej zarówno w profilaktyce, jak i w ocenie zastosowanego leczenia endoskopowego oraz chirurgicznego. Ocena chorych diagnozowanych tą metodą pozwoliła na wyodrębnienie szeregu wskazań do jej wykorzystania w gastroenterologii.

Do takich wskazań należą:

• wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zwłaszcza trwające ponad 7 lat
• zapalenie całej okrężnicy
• zapalenie lewej połowy okrężnicy trwające 10-12 lat
• ocena polipów jelita grubego, szczególnie o charakterze adenoma villosum i tubulovillosum
• ocena mnogich zmian o charakterze polipowatym
• okresowa ocena zespolenia po resekcji z powodu raka jelita grubego, szczególnie u chorych z podejrzeniem wznowy procesu nowotworowego na podstawie objawów klinicznych i wyników oznaczeń markerów biochemicznych
• ocena chorych na zespoły genetyczne, w przebiegu których ryzyko wystąpienia raka jelita grubego jest zwiększone.

  

  Rycina 1. Zmiana o charakterze przełyku Barretta w endoskopii autofluorescencyjnej (materiał własny).

  

  Rycina 2. Zmiana o charakterze przełyku Barretta w obrazowaniu w świetle białym (materiał własny).

W górnym odcinku przewodu pokarmowego diagnostyka autofluorescencyjna jest metodą szeroko stosowaną w poszukiwaniu ognisk dysplastycznych w obrębie przełyku Barretta (ryc. 1 i 2) i celowanym pobieraniu wycinków do badania histopatologicznego, a także w ocenie łagodnych zmian ektopowych lub brodawczakowatych w obrębie jamy ustnej i przełyku.

Zastosowanie w ginekologii

W ginekologii rozpatruje się możliwości wykorzystania diagnostyki autofluorescencyjnej w ocenie wczesnych zmian sromu oraz szyjki macicy.

Do wymienianych w piśmiennictwie najczęstszych wskazań do zastosowania tej metody należą:

• ocena chorych z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego wymazu pobranego z szyjki macicy – cechami zmiany środnabłonkowej dużego stopnia (HSIL – high stage intraepithelial lesions)
• oceny sromu po leczeniu radykalnym z powodu nowotworu sromu u chorych z cechami wznowy
• ocena zmian o charakterze liszaja twardzinowego lub liszaja z potwierdzoną dysplazją (VIN I – vulvar intraepithelial neoplasia I, VIN II, VIN III).

Szczególną uwagę poświęca się ocenie skuteczności obrazowania u kobiet z potwierdzonym zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV – human papillomavirus), bez objawów klinicznych i bez zmian w badaniu ginekologicznym, ale z potwierdzoną dysplazją w badaniu cytologicznym (VIN I, VIN II, VIN III).

Zastosowanie w urologii

W piśmiennictwie bardzo podkreśla się możliwości wykorzystania obrazowania fotodynamicznego w urologii, zwłaszcza u chorych na raka pęcherza moczowego.

Metoda ta jest szczególnie przydatna u chorych:

• z podejrzeniem śródnabłonkowego (in situ) raka pęcherza moczowego (z krwiomoczem bez wyraźniej przyczyny lub objawami zapalenia pęcherza moczowego niepoddającymi się leczeniu przez co najmniej 3 miesiące)
• po przezcewkowej resekcji ogniska lub ognisk raka pęcherza – w celu weryfikacji doszczętności zabiegu
• obserwowanych w celu rozpoznania nowych lub nawrotowych ognisk nowotworu.

W piśmiennictwie podkreśla się minimalnie inwazyjny charakter kontrolnych badań fotodynamicznych u chorych leczonych z powodu raka pęcherza moczowego.

Biopsja optyczna

Biopsja optyczna jest metodą w prostej linii wywodzącą się ze spektroskopii molekularnej, pozwalającą na wykrywanie substancji o właściwościach fotofizycznych wchodzących w skład tkanek. W badaniach doświadczalnych oświetlano stosunkowo niewielkie obszary tkanek światłem monochromatycznym o odpowiednich długościach fali, doprowadzając do emisji promieniowania z zakresu światła widzialnego.

Rycina 3. Widmo fluorescencyjne uzyskane w obrazowaniu skóry zdrowej (materiał własny).

Rycina 4. Widmo fluorescencyjne zmiany o charakterze raka podstawnokomórkowego skóry (materiał własny).

Rycina 5. Przestrzenna analiza natężenia fluorescencji zmiany o charakterze raka podstawnokomórkowego skóry pozwalająca na uwidocznienie miejsc o największej retencji substancji optycznie czynnych w komórkach guza (materiał własny).

W tej fazie badań z metodą wiązano duże nadzieje, zwłaszcza z jej wykorzystaniem w różnicowaniu histologicznym na podstawie składu substancji optycznie czynnych zawartych w tkankach poszczególnych nowotworów. Dlatego metodę nazwano biopsją optyczną. Pozyskano dzięki niej widma charakterystyczne dla kilku rodzajów nowotworów, późniejsze analizy wykazały jednak, że na uzyskiwane wyniki zbyt duży wpływ miały inne czynniki biologiczne oraz fizyczne, zakłócające późniejszą interpretację obrazów widmowych (ryc. 3-5).

Przeprowadzone badania laboratoryjne oraz kliniczne dały podstawy dla opracowania algorytmów analizy widma fluorescencyjnego, dzięki czemu osiągnięto znamiennie większą powtarzalność rezultatów. Równie istotne wydawało się zastosowanie pomiarów natężeń poszczególnych długości fali widma emisyjnego w celu identyfikacji i różnicowania substancji wchodzących w skład tkanek. Kolejnym problemem diagnostycznym, szczególnie istotnym w badaniach in vivo, były zakłócenia pochodzące z widma emisyjnego hemoglobiny. Wyniki badań pozwoliły na wprowadzenie szeregu modyfikacji metodycznych, co znacznie zwiększyło przydatności tej metody analizy optycznej materiału tkankowego. Stała się ważnym czynnikiem usprawniającym diagnostykę fotodynamiczną oraz obrazowanie autofluorescencyjne.

Zastosowanie w endoskopii

Prowadzone obecnie badania kliniczne wykazały, że biopsja optyczna może być istotnym elementem wspomagającym diagnostykę endoskopową, a zwłaszcza zwiększać czułość i trafność pobierania wycinków tkankowych podczas wziernikowania narządów. Dzięki odpowiednim przekształceniom cyfrowym obrazów autofluorescencyjnego i fluorescencyjnego wykazano, iż natężenie fluorescencji w miejscach o największej aktywności procesu nowotworowego jest istotnie większe niż na innych obszarach tkanki guza. Tym samym przekształcenia cyfrowe obrazu autofluorescencyjnego i fluorescencyjnego pozwoliły na ukazanie w przestrzeni, w czasie rzeczywistym, natężenia fluorescencji w zmianie nowotworowej, co ułatwia wybór miejsc pobrania reprezentatywnego materiału biopsyjnego. W dalszych badaniach stwierdzono dużą skuteczność przestrzennego obrazowania fluorescencji w monitorowaniu przebiegu choroby i odpowiedzi na zastosowane leczenie, wykrywaniu nawrotów nowotworu oraz satelitarnych skupisk tkanki nowotworowej w obrębie tkanki makroskopowo prawidłowej. Wykorzystanie obrazowania fluorescencyjnego może istotnie zwiększyć skuteczność leczenia endoskopowego i chirurgicznego, ułatwia bowiem jednoznaczne określenie marginesu tkanki nowotworowej i tkanki zdrowej, dzięki czemu zmniejsza się odsetek nawrotów choroby. Wyniki przeprowadzonych dotychczas badań są zachęcające i skłaniają do poszukiwania nowych zastosowań biopsji optycznej.

Podsumowanie

Rozwój metod endoskopowych oceny tkanek znacznie zwiększył dotychczasowe możliwości diagnostyczne we współczesnej onkologii. W piśmiennictwie często podkreśla się zalety metod obrazowania wykorzystujących zjawiska fluorescencyjne i autofluorescencyjne. Dostępne na rynku aparaty do obrazowania endoskopowego stwarzają obecnie możliwości jednoczesnego obrazowania zarówno tradycyjnie, w świetle białym, jak i we fluorescencji, co istotnie wpływa na jakość uzyskiwanych wyników biopsji. Techniki obrazowania fluorescencyjnego są zatem przedmiotem wielu badań doświadczalnych i klinicznych prowadzonych na świecie i w Polsce. Rezultaty dotychczasowych badań zdają się potwierdzać dużą skuteczność oceny autofluorescencyjnej i fluorescencyjnej biopsji optycznej w poszukiwaniu zmian nowotworowych, szczególnie małych, niewidocznych w świetle białym. Cenne jest również wykorzystywanie tych metod obrazowania endoskopowego w wykrywaniu zmian przednowotworowych, a także w badaniach przesiewowych populacji obciążonych zwiększonym ryzykiem zachorowania na nowotwór. W piśmiennictwie podkreśla się, że metoda ta, cechująca się minimalną inwazyjnością, powinna uzupełniać dotychczasową diagnostykę onkologiczną, pozwala bowiem na jednoznaczne określenie charakteru badanych zmian. Konieczne jest zatem prowadzenie badań klinicznych z udziałem dużych grup chorych, ponieważ pozwoli to na poszerzenie dotychczasowego zakresu wykorzystywania metod fluorescencyjnych we współczesnej diagnostyce onkologicznej.