W SKRÓ­CIE

Od­kry­cie 2 typu en­zy­mu kon­wer­tu­ją­ce­go an­gio­ten­sy­nę (ACE2) wpro­wa­dza no­wy sto­pień zło­żo­no­ści w po­strze­ga­niu ukła­du re­ni­na­-an­gio­ten­sy­na. Du­ża spraw­ność ka­ta­li­tycz­na ACE2, wy­twa­rza­ją­ce­go an­gio­ten­sy­nę (Ang) 1-7 z Ang II, wska­zu­je na waż­ną funk­cję ACE2 ja­ko me­cha­ni­zmu za­po­bie­ga­ją­ce­go gro­ma­dze­niu się Ang II, a jed­no­cze­śnie zwięk­sza­ją­ce­go wy­twa­rza­nie Ang 1-7. ACE i ACE2 mo­gą wy­wie­rać prze­ciw­staw­ne dzia­ła­nia, ści­śle re­gu­lu­jąc szyb­kość wy­twa­rza­nia i de­gra­da­cji pep­ty­dów an­gio­ten­sy­ny. Prze­ciw­dzia­ła­jąc ak­tyw­no­ści ACE w za­kre­sie wy­twa­rza­nia Ang II, ACE2 mo­że od­gry­wać ro­lę w utrzy­my­wa­niu od­po­wied­niej rów­no­wa­gi ukła­du re­ni­na­-an­gio­ten­sy­na. W prze­glą­dzie skon­cen­tro­wa­no się na dzia­ła­niu ACE2 oraz je­go moż­li­wej ro­li w cho­ro­bach ne­rek i nad­ci­śnie­niu tęt­ni­czym. Na pod­sta­wie wy­ni­ków ba­dań, w któ­rych sto­so­wa­no mo­de­le ge­ne­tycz­nej abla­cji ACE2 oraz sto­so­wa­no in­hi­bi­to­ry ACE2, moż­na są­dzić, że zmniej­szo­na ak­tyw­ność ACE2, sa­ma lub w po­łą­cze­niu ze zwięk­szo­ną ak­tyw­no­ścią ACE, mo­że od­gry­wać ro­lę w obu tych cho­ro­bach.

Wpro­wa­dze­nie

Pierw­szy ludz­ki ho­mo­log en­zy­mu kon­wer­tu­ją­ce­go an­gio­ten­sy­nę (ACE), na­zwa­ny en­zy­mem kon­wer­tu­ją­cym an­gio­ten­sy­nę ty­pu 2 (ACE2), zo­stał zi­den­ty­fi­ko­wa­ny w 2000 r. przez dwie nie­za­leż­ne gru­py ba­daw­cze sto­su­ją­ce me­to­dy ge­no­micz­ne.^1,2 Gen ko­du­ją­cy ACE2, ozna­cza­ny ja­ko Ace2, znaj­du­je się na chro­mo­so­mie X. Po­dob­nie jak ACE, ACE2 jest in­te­gral­nym biał­kiem bło­no­wym ty­pu 1, za­wie­ra jed­nak tyl­ko jed­ną ak­tyw­ną do­me­nę i skła­da się z 805 ami­no­kwa­sów.^1,2 ACE2 dzia­ła ja­ko kar­bok­sy­pep­ty­da­za usu­wa­ją­ca po­je­dyn­cze ami­no­kwa­sy z C­-koń­ca czą­ste­czek jej sub­stra­tów, na­to­miast ACE dzia­ła głów­nie ja­ko pep­ty­dy­lo­di­pep­ty­da­za, któ­ra usu­wa C­-koń­co­we di­pep­ty­dy. Me­ta­lo­pro­te­azo­we do­me­ny ka­ta­li­tycz­ne ACE2 i ACE są iden­tycz­ne w 41%, a wy­ni­ki po­rów­na­nia struk­tu­ry ge­no­micz­nej wska­zu­ją, że te dwa ge­ny po­wsta­ły w wy­ni­ku du­pli­ka­cji wspól­ne­go przod­ka.^1,2 Dzię­ki po­zna­niu trój­wy­mia­ro­wej struk­tu­ry ze­wną­trz­ko­mór­ko­wej do­me­ny ACE2³ stwier­dzo­no, że me­cha­nizm ka­ta­li­tycz­ny ACE2 ści­śle przy­po­mi­na me­cha­nizm ka­ta­li­tycz­ny ACE. Kie­sze­nie wią­żą­ce sub­strat róż­nią się jed­nak istot­nie,³ co tłu­ma­czy róż­ni­ce swo­isto­ści sub­stra­tów mię­dzy dwo­ma en­zy­ma­mi, a tak­że brak wią­za­nia in­hi­bi­to­rów ACE i ha­mo­wa­nia ACE2 przez te le­ki.⁴

ACE2 jest je­dy­nym zna­nym ak­tyw­nym en­zy­ma­tycz­nie ho­mo­lo­giem ACE w ludz­kim ge­no­mie. Ko­niec kar­bok­sy­lo­wy czą­stecz­ki ACE2 jest ho­mo­lo­gicz­ny z ko­lek­try­ną.⁵ W prze­ci­wień­stwie do ACE i ACE2 ko­lek­try­na nie ma wła­ści­wo­ści ka­ta­li­tycz­nych kar­bok­sy­pep­ty­da­zy i po­cząt­ko­wo zlo­ka­li­zo­wa­no ją w cew­kach zbior­czych.⁵ Ostat­nio jed­nak zi­den­ty­fi­ko­wa­no ją rów­nież w cew­kach bliż­szych, gdzie uczest­ni­czy w re­gu­la­cji wy­chwy­tu ami­no­kwa­sów.^6,7 Wska­zy­wa­no też na moż­li­wą ro­lę ko­lek­try­ny w two­rze­niu się i roz­wo­ju pę­che­rza mo­czo­we­go po­przez in­te­rak­cję z in­te­gral­ny­mi biał­ka­mi bło­no­wy­mi swo­isty­mi dla rzę­sek.⁸ W ge­no­mach kil­ku ga­tun­ków ssa­ków zi­den­ty­fi­ko­wa­no jesz­cze in­ny gen ko­du­ją­cy no­we, skła­da­ją­ce się z jed­nej do­me­ny biał­ko po­dob­ne do ACE, któ­re na­zwa­no ACE3. Wy­da­je się, że u kil­ku ga­tun­ków ACE3 nie wy­ka­zu­je ak­tyw­no­ści ka­ta­li­tycz­nej ja­ko me­ta­lo­pro­te­aza cyn­ko­wa.⁹ Co wię­cej, u lu­dzi w ogó­le nie uzy­ska­no do­wo­dów eks­pre­sji ge­nu ko­du­ją­ce­go ACE3, a obec­ność de­le­cji i in­ser­cji w je­go se­kwen­cji po­zwa­la są­dzić, że u lu­dzi se­kwen­cja ko­du­ją­ca ACE3 jest pseu­do­ge­nem.⁹

Obec­ność ACE2 po­cząt­ko­wo wy­kry­to w ser­cu, ner­kach i ją­drach, a mniej­sze ilo­ści te­go en­zy­mu rów­nież w okręż­ni­cy, je­li­cie cien­kim i jaj­ni­kach.¹⁰ ACE2 zi­den­ty­fi­ko­wa­no też w płu­cach, gdzie od­gry­wa on waż­ną ro­lę w me­ta­bo­li­zmie an­gio­ten­sy­ny (Ang) II.^11,12 ACE2 chro­ni my­szy przed cięż­kim uszko­dze­niem płuc wy­wo­ły­wa­nym przez aspi­ra­cję kwa­śnej tre­ści, sep­sę lub za­ka­że­nie wi­ru­sem cięż­kiej ostrej nie­wy­dol­no­ści od­de­cho­wej (SARS).^11,12 Ja­ko pierw­si wy­ra­zi­li­śmy po­gląd, że ACE2 mo­że dzia­łać ochron­nie na ner­ki, zwłasz­cza w po­łą­cze­niu z ma­łą ak­tyw­no­ścią ACE.¹³ Naj­now­sze pra­ce prze­pro­wa­dzo­ne w na­szym la­bo­ra­to­rium po­twier­dza­ją tę hi­po­te­zę.^14-16 W prze­glą­dzie oma­wia­my ostat­nie pu­bli­ka­cje do­ty­czą­ce ACE2 ja­ko szla­ku me­ta­bo­li­zmu Ang II oraz moż­li­wej ro­li te­go en­zy­mu w nad­ci­śnie­niu tęt­ni­czym i ne­fro­pa­tii cu­krzy­co­wej.

Sub­stra­ty ACE2

Ry­ci­na 1. Strzał­ki pio­no­we po le­wej stro­nie przed­sta­wia­ją kla­sycz­ny szlak po­wsta­wa­nia an­gio­ten­sy­ny II z udzia­łem en­zy­mu kon­wer­tu­ją­ce­go an­gio­ten­sy­nę (ACE) oraz me­cha­ni­zmów nie­za­leż­nych od ACE. Strzał­ki po­zio­me przed­sta­wia­ją dzia­ła­nia póź­niej od­kry­te­go ACE2

Od­kry­cie ACE2 wpro­wa­dza no­wy sto­pień zło­żo­no­ści w po­strze­ga­niu ukła­du re­ni­na­-an­gio­ten­sy­na. ACE2 jest kar­bok­sy­pep­ty­da­zą, któ­ra ka­ta­li­zu­je prze­kształ­ca­nie Ang II w Ang 1-7 oraz Ang I  w Ang 1-9 (ryc. 1).^1,2,17 Nie wie­my, że­by Ang 1-9 wy­wie­ra­ła wpływ na na­czy­nia krwio­no­śne, ale mo­że być prze­kształ­ca­na przez ACE w krót­szy pep­tyd, Ang 1-7, któ­ry roz­sze­rza na­czy­nia (ryc. 1). Ang I (skła­da­ją­ca się z 10 ami­no­kwa­sów) to pep­tyd po­śred­ni po­zba­wio­ny zna­nych dzia­łań bio­lo­gicz­nych. Ang I jest prze­kształ­ca­na w Ang 1-9 (skła­da­ją­cą się z dzie­wię­ciu ami­no­kwa­sów) przez ACE2, na­to­miast ACE prze­kształ­ca ją w Ang II, skła­da­ją­cą się z ośmiu ami­no­kwa­sów (ryc. 1). Dzia­ła­nia ACE2 po­win­ny więc za­po­bie­gać gro­ma­dze­niu się Ang II, któ­ra ma dzia­ła­nie kur­czą­ce na­czy­nia krwio­no­śne, oraz pro­wa­dzić do po­wsta­wa­nia Ang 1-7, któ­ra dzia­ła na­czy­nio­roz­kur­czo­wo.

ACE i ACE2 mo­gą wy­wie­rać prze­ciw­staw­ne dzia­ła­nia, ści­śle re­gu­lu­jąc szyb­kość wy­twa­rza­nia i de­gra­da­cji pep­ty­dów Ang. ACE2 cha­rak­te­ry­zu­je się du­żą spraw­no­ścią ka­ta­li­tycz­ną prze­kształ­ca­nia Ang II w Ang 1-7.¹⁷ Wska­zu­je to na waż­ną ro­lę ACE2 ja­ko me­cha­ni­zmu za­po­bie­ga­ją­ce­go gro­ma­dze­niu się Ang II, a jed­no­cze­śnie zwięk­sza­ją­ce­go wy­twa­rza­nie Ang 1-7. Ostat­nio wy­ka­za­no, że Ang 1-7 ha­mu­je fos­fo­ry­la­cję ki­na­zy ak­ty­wo­wa­nej przez mi­to­ge­ny (MAPK) na­stę­pu­ją­cą pod wpły­wem Ang II w ko­mór­kach ce­wek bliż­szych w ner­kach.¹⁸ Wy­twa­rza­nie Ang 1-7 przez ACE2 w cew­kach bliż­szych mo­gło­by więc rów­nież od­gry­wać ro­lę ja­ko me­cha­nizm rów­no­wa­żą­cy dzia­ła­nia miej­sco­wo wy­twa­rza­nej Ang II.¹⁸

De­gra­da­cję Ang II do Ang 1-7 pod wpły­wem ACE2 udo­ku­men­to­wa­no w ba­da­niach, w któ­rych wy­ko­rzy­sty­wa­no pre­pa­ra­ty ko­ry ne­rek lub izo­lo­wa­ne cew­ki bliż­sze.^19-21 Stwier­dzo­no, że po­wi­no­wac­two ACE2 do Ang II prze­kształ­ca­nej w Ang 1-7 jest za­sad­ni­czo więk­sze niż po­wi­no­wac­two do Ang I prze­kształ­ca­nej w Ang 1-9.^19-21 W świe­żo wy­pre­pa­ro­wa­nych seg­men­tach ce­wek bliż­szych u szczu­rów Li i wsp.²² ob­ser­wo­wa­li jed­nak za­leż­ne od ACE2 wy­twa­rza­nie Ang 1-7 z Ang I, któ­re obej­mo­wa­ło prze­kształ­ce­nie Ang I w Ang 1-9, a na­stęp­nie tra­wie­nie Ang 1-9 przez ACE z wy­two­rze­niem Ang 1-7. Au­to­rzy in­ne­go ba­da­nia do­ty­czą­ce­go tkan­ki ser­ca stwier­dzi­li, że ACE2 mo­że dzia­łać prze­ciw­staw­nie do ACE za po­śred­nic­twem Ang 1-9 za­miast Ang 1-7.²³

Ta­be­la 1. Se­kwen­cje ami­no­kwa­so­we i miej­sca hy­dro­li­zy pep­ty­dów me­ta­bo­li­zo­wa­nych przez en­zym kon­wer­tu­ją­cy an­gio­ten­sy­nę ty­pu 2

Wie­dza na te­mat pep­ty­dów bę­dą­cych bio­lo­gicz­ny­mi sub­stra­ta­mi ACE2 jest przy­dat­na ja­ko źró­dło wstęp­nych da­nych do­ty­czą­cych swo­isto­ści dzia­ła­nia tej pro­te­azy oraz fi­zjo­lo­gicz­nej ro­li ACE2. Je­że­li ACE2 jest „en­zy­mem kon­wer­tu­ją­cym” po­dob­nie jak ACE, to efek­tem je­go ak­tyw­no­ści ja­ko pep­ty­da­zy jest wy­twa­rza­nie lub de­gra­da­cja pep­ty­dów wy­ka­zu­ją­cych ak­tyw­ność bio­lo­gicz­ną.¹⁷ Po­zna­nie bio­lo­gicz­nej ak­tyw­no­ści sub­stra­tów i pro­duk­tów ACE2 do­star­cza więc in­for­ma­cji na te­mat praw­do­po­dob­nych fi­zjo­lo­gicz­nych funk­cji ACE2.¹⁷ Bio­lo­gicz­nie ak­tyw­ne pep­ty­dy bę­dą­ce sub­stra­ta­mi tra­wio­ny­mi przez ACE2 przed­sta­wio­no w ta­be­li 1. Choć głów­ny­mi zna­ny­mi sub­stra­ta­mi ACE są pep­ty­dy Ang I i Ang II, ACE2 rów­nież mo­że hy­dro­li­zo­wać kil­ka in­nych pep­ty­dów. ACE2 nie tra­wi bra­dy­ki­ni­ny, ale in­ak­ty­wu­je za­rów­no des­-Ar­g9­-bra­dy­ki­ni­nę, jak i lys­-des­-Ar­g9­-bra­dy­ki­ni­nę.¹⁷

ACE2 mo­że rów­nież odłą­czać C­-koń­co­wą resz­tę od czą­stecz­ki ape­li­ny i in­nych pep­ty­dów na­czy­nio­ak­tyw­nych, ta­kich jak neu­ro­ten­sy­na, ki­ne­ten­sy­na (pep­tyd po­krew­ny neu­ro­ten­sy­nie) i des­-Arg­-bra­dy­ki­ni­na.¹⁰ ACE2 cha­rak­te­ry­zu­je się du­żą ka­ta­li­tycz­ną wy­daj­no­ścią hy­dro­li­zy pep­ty­dów ape­li­ny­-13 i ape­li­ny­-36.¹⁰ Ape­li­na zwięk­sza kurcz­li­wość mię­śnia ser­co­we­go i zmniej­sza na­pię­cie na­czy­nio­ru­cho­we.¹⁰ Dwa pep­ty­dy opio­ido­we, dy­nor­fi­na A i β­-ka­zo­mor­fi­na, tak­że są sub­stra­ta­mi ACE2.^10,17 Te dwa pep­ty­dy po­bu­dza­ją re­cep­to­ry opio­ido­we κ i δ sprzę­żo­ne z biał­ka­mi G i mo­gą wy­wie­rać ne­ga­tyw­ny wpływ na kurcz­li­wość kar­dio­mio­cy­tów.¹⁰

Me­to­dy ozna­cza­nia ak­tyw­no­ści ACE2

Opra­co­wa­no kil­ka me­tod ozna­cza­nia ak­tyw­no­ści ACE2 w tkan­kach. W pi­śmien­nic­twie opi­sa­no za­sto­so­wa­nie w tym ce­lu róż­nych tech­nik, w tym wy­so­ko­wy­daj­nej chro­ma­to­gra­fii cie­czo­wej (HPLC),²⁴ spek­tro­me­trii ma­so­we­j^20,22 i flu­ory­me­trii.^16,23,25-27 W me­to­dach opar­tych na HPLC i spek­tro­me­trii ma­so­wej wy­ko­rzy­stu­je się en­do­gen­ny sub­strat pep­ty­do­wy (Ang II) i dzię­ki nim uzy­sku­je in­for­ma­cje na te­mat po­szcze­gól­nych pep­ty­dów po­wsta­ją­cych w wy­ni­ku re­ak­cji hy­dro­li­zy. Za­le­tą me­tod z wy­ko­rzy­sta­niem flu­oro­gen­nych sub­stra­tów pep­ty­do­wych jest moż­li­wość pro­stej, szyb­kiej i wy­god­nej ilo­ścio­wej oce­ny tkan­ko­wej ak­tyw­no­ści ACE2 w wie­lu prób­kach jed­no­cze­śnie.¹⁶

Obec­nie naj­czę­ściej sto­so­wa­ne me­to­dy po­mia­ru ak­tyw­no­ści ACE2 opie­ra­ją się na wy­ko­rzy­sta­niu flu­oro­gen­nych sub­stra­tów pep­ty­do­wych Mca­-YVA­DAPK(Dnp) lub Mca­-APK(Dnp).^16,23,25-27 W tych ozna­cze­niach sub­strat pep­ty­do­wy za­wie­ra flu­ore­scen­cyj­ną gru­pę 7-me­tok­sy­ku­ma­ry­ny (Mca), któ­rej świe­ce­nie za­ni­ka po prze­nie­sie­niu ener­gii na czą­stecz­kę 2,4-di­ni­tro­fe­ny­lu (Dnp). Re­ak­cja ta jest opar­ta na tra­wie­niu wią­za­nia ami­do­we­go mię­dzy gru­pą flu­ore­scen­cyj­ną a gru­pą wy­ga­sza­ją­cą świe­ce­nie, co po­wo­du­je zwięk­sze­nie flu­ore­scen­cji.²⁸ Me­to­dę tę moż­na wy­ko­rzy­sty­wać do po­mia­ru ak­tyw­no­ści ACE2 i in­nych pep­ty­daz.²⁸

Sy­gnał flu­ore­scen­cji Mca­-YVA­DAPK(Dnp) jest czę­ścio­wo wy­ga­sza­ny przez swo­iste in­hi­bi­to­ry za­rów­no ACE, jak i ACE2, na­to­miast ta­kie­go efek­tu nie wy­wo­łu­je in­hi­bi­tor in­nej me­ta­lo­pro­te­azy, kar­bok­sy­pep­ty­da­zy A.¹⁶ Wy­ko­rzy­sta­li­śmy to po­dwój­ne dzia­ła­nie w ce­lu opra­co­wa­nia me­to­dy umoż­li­wia­ją­cej jed­no­cze­sne ozna­cza­nie ak­tyw­no­ści ACE i ACE2.¹⁶ Kom­bi­na­cja swo­istych in­hi­bi­to­rów ACE i ACE2 wy­ga­sza­ła sy­gnał flu­ore­scen­cji nie­mal cał­ko­wi­cie i w ta­kim sa­mym stop­niu jak kwas ety­le­no­dia­mi­no­te­tra­oc­to­wy (ED­TA – zwią­zek che­la­tu­ją­cy jo­ny me­ta­li), co wska­zu­je na to, że oba me­ta­lo­en­zy­my – ACE i ACE2 – uczest­ni­czą w de­gra­da­cji sub­stra­tu. Jak za­uwa­żo­no wy­żej, po­dwój­ne tra­wie­nie te­go sub­stra­tu przez ACE i ACE2 umoż­li­wia jed­no­cze­sny po­miar ak­tyw­no­ści tych dwóch kar­bok­sy­pep­ty­daz w prób­kach tka­nek.¹⁶ Jest to szcze­gól­nie waż­ne, po­nie­waż ACE2 i ACE wy­stę­pu­ją ra­zem w wie­lu tkan­kach, w któ­rych wy­ka­za­no ak­tyw­ność ka­ta­li­tycz­ną obu tych en­zy­mów.²⁹ Oce­na ak­tyw­no­ści ACE2, je­dy­ne­go czyn­ne­go ho­mo­lo­gu ACE, w po­łą­cze­niu z oce­ną ak­tyw­no­ści ACE jest przy­dat­na w ba­da­niach nad ro­lą ukła­du re­ni­na­-an­gio­ten­sy­na w pa­to­fi­zjo­lo­gii róż­nych sta­nów cho­ro­bo­wych.¹⁴

Ak­tyw­ność ACE2 mie­rzo­no rów­nież za po­mo­cą in­ne­go sub­stra­tu flu­oro­gen­ne­go – Mca­-APK(Dnp).^25-27 Tą me­to­dą wy­kry­wa­no ak­tyw­ność ACE2 w prób­kach oso­cza uzy­ska­nych od my­szy cha­rak­te­ry­zu­ją­cych się nad­mier­ną eks­pre­sją ACE2 (ale nie w przy­pad­ku my­szy ty­pu dzi­kie­go),²⁶ a tak­że w tkan­ce ser­ca szczu­ra^­25 i w ją­drach szczu­ra.²⁷ Po­słu­gu­jąc się tym sub­stra­tem w tkan­kach my­sich, nie by­li­śmy jed­nak w sta­nie wy­ga­sić flu­ore­scen­cji za po­mo­cą in­hi­bi­to­ra ACE2, MLN­-4760. Co wię­cej, Mca­-APK(Dnp) ja­ko sub­strat jest wy­so­ce wy­biór­czy dla ACE­2²⁶ i w związ­ku z tym nie moż­na go wy­ko­rzy­sty­wać do jed­no­cze­snych po­mia­rów ak­tyw­no­ści ACE i ACE2.

Fer­ra­rio i wsp.²⁴ do po­mia­ru ak­tyw­no­ści ACE2 w bło­nach ko­mó­rek ser­ca za­sto­so­wa­li me­to­dę opar­tą na HPLC, a póź­niej roz­sze­rzo­no jej za­sto­so­wa­nie na ozna­cze­nia w in­nych tkan­kach i pły­nach cia­ła.²¹ Me­to­da jest dwu­eta­po­wa: naj­pierw in­ku­bu­je się z ACE2 sub­stra­ty pep­ty­do­we zna­ko­wa­ne izo­to­pem pro­mie­nio­twór­czym, a na­stęp­nie wy­ko­rzy­stu­je się HPLC do roz­dzia­łu pro­duk­tów ak­tyw­no­ści te­go en­zy­mu. Me­to­da opar­ta na HPLC wy­ko­rzy­stu­je zdol­ność ACE2 do hy­dro­li­zo­wa­nia Ang II z wy­two­rze­niem Ang 1-7.¹⁷ Szyb­kość prze­kształ­ca­nia en­do­gen­nej Ang II zna­ko­wa­nej izo­to­pem pro­mie­nio­twór­czym w Ang 1-7 w obec­no­ści in­hi­bi­to­ra ACE2 lub przy je­go bra­ku jest wskaź­ni­kiem ak­tyw­no­ści en­zy­ma­tycz­nej ACE2.²⁴ Po­nie­waż ta me­to­da wy­ma­ga za­sto­so­wa­nia HPLC, pro­ces ozna­cza­nia jest sto­sun­ko­wo cza­so­chłon­ny, ale bez­po­śred­nio do­star­cza in­for­ma­cji na te­mat po­wsta­wa­nia Ang 1-7.