Diagnostyka preimplantacyjna podczas zabiegów zapłodnienia in vitro – perspektywy i wyzwania

na pobraniu i zbadaniu komórek trofoektodermy, które uzyskuje się z rozwijającej blastocysty, typowo po 5-6 dniach od pobrania oocytu ² .

W zależności od celu badania pobrane komórki można poddawać różnym analizom. PGT mają kilka różnych zastosowań, w tym badania w kierunku:

• aneuploidii (PGT-A – preimplantation genetic testing for aneuploidy)
• chorób jednogenowych (PGT-M – preimplantation genetic testing for monogenic disease)
• rearanżacji strukturalnych (PGT-SR – preimplantation genetic testing for structural rearrangements).

Nowsze zastosowanie diagnostyki preimplantacyjnej, którego wartości wciąż nie udowodniono, polega na badaniach przesiewowych w kierunku chorób poligenicznych (PGT-P – preimplantation testing for polygenic disease). Istotą PGT-A jest ocena zarodków powstałych dzięki metodzie IVF w celu zbadania ich pod kątem kompletu chromosomów i ustalenia, które zarodki są chromosomalnie prawidłowe (euploidalne), a które nie (aneuploidalne). PGT-M wykonuje się w celu zmniejszenia ryzyka wystąpienia określonych chorób genetycznych u dziecka.

Podczas PGT-SR dokonuje się przesiewowej oceny w kierunku strukturalnych rearanżacji chromosomalnych, które zwykle mają charakter zrównoważonych translokacji lub inwersji, a badanie to wykonuje się najczęściej u par z wywiadami nawracających poronień. PGT-P można wykorzystywać do określenia potencjalnego ryzyka rozwoju chorób o późnym początku i dziedziczeniu poligenicznym, w tym: cukrzycy, chorób układu krążenia oraz niektórych nowotworów złośliwych. Preimplantacyjne badanie zgodności tkankowej zarodka (PGT-HLA – preimplantation genetic testing-human leukocyte antigen) wykorzystuje się do dobierania pod względem antygenów zgodności tkankowej w układzie HLA w celu zapewnienia zgodności płodu z potencjalnym biorcą, zwykle wymagającym przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych.

Historia PGT

W ostatnich latach znacznie zwiększyło się zastosowanie PGT, z mniej więcej 1000 cykli ART w połowie pierwszej dekady XXI wieku do nieco poniżej 19 000 cykli w 2014 roku, ponad 54 000 cykli w 2017 roku i obecnie blisko 40% cykli ART w Stanach Zjednoczonych ³ . Ogromną większość wykonywanych zabiegów stanowią PGT-A. PGT uległy kilku zmianom od czasu wprowadzenia tego rodzaju badań genetycznych. Początkowe próby PGT-A w latach 90. XX wieku podejmowane na zarodkach znajdujących się na etapie kilku komórek (dzień 3) były nieskuteczne z kilku przyczyn. Ze względu na wczesny mozaicyzm zarodka ograniczona liczba uzyskanych komórek często nie była reprezentatywna dla ostatecznej rzeczywistej linii komórkowej zarodka, a dostępna technologia – zwykle fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH – fluorescence in situ hybridization) – pozwalała na ocenę jedynie ograniczonej liczby (typowo 5-10) określonych nieprawidłowości chromosomalnych. W doniesieniach z tamtego okresu nie potwierdzono skuteczności PGT-A z użyciem metody FISH – wykazano dużą częstość błędów ⁴ . W rezultacie kilka towarzystw naukowych, w tym American Society for Reproductive Medicine (ASRM), nie zalecało PGT-A ⁵ .

Później wprowadzono kilka metod umożliwiających pełną przesiewową ocenę wszystkich 24 chromosomów, w tym: porównawczą hybrydyzację genomową do mikromacierzy (aCGH – array comparative genomic hybridization), ocenę polimorfizmów pojedynczych nukleotydów z użyciem mikromacierzy (SNPa – single nucleotide polymorphism arrays), ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR – quantitative polymerase chain reaction), a ostatnio sekwencjonowanie następnej generacji (NGS – next-generation sequencing). Zastosowanie tych metod na etapie blastocysty (dzień 5 lub 6) umożliwiło uzyskanie większej liczby komórek trofoektodermy, co zwiększyło dokładność diagnostyczną i zmniejszyło szkodliwość wpływu tego zabiegu na zarodek, ponieważ pobiera się relatywnie mniejszą część masy komórek na późniejszym etapie rozwoju zarodka ^{6, 7} . Kolejne postępy dotyczące hodowli komórek blastocysty, metod inkubacji, witryfikacji zarodków oraz metod molekularnych umożliwiających ocenę liczby kopii we wszystkich chromosomach spowodowały dalszą poprawę wskaźników uzyskiwanych ciąż i zmniejszenie częstości błędów ² . Obecnie stosowane metody, w tym qPCR i NGS, mają określone ograniczenia i zalety.

Potencjalna wartość PGT-A

Badanie genetyczne zarodków w kierunku aneuploidii ma kilka potencjalnych zalet podczas IVF. Jeżeli wykonuje się PGT-A, a następnie dokonuje transferu chromosomalnie prawidłowego zarodka, można zwiększyć odsetek implantacji zarodków i uzyskiwanych ciąż, co pozwoliło wielu ośrodkom IVF na zwiększenie częstości wykonywania planowego transferu pojedynczego zarodka i w ten sposób redukcję w zakresie występowania ciąż wielopłodowych. W rezultacie od 2014 roku nastąpiło istotne zmniejszenie częstości ciąż bliźniaczych i wyższego rzędu, podczas gdy w ciągu trzech poprzednich dekad częstość ta rosła z roku na rok ⁷ . U kobiet, które otrzymują euploidalny zarodek, obserwuje się również poprawę ogólnych wyników ciąży i zmniejszenie częstości występowania poronień, zwłaszcza w przypadku bardziej zaawansowanego wieku matki ⁸ . Wykazano również, że u kobiet z nawracającymi poronieniami następuje skrócenie czasu do zajścia w ciążę w porównaniu z postępowaniem wyczekującym.

Komu należy oferować PGT?

Pełna przesiewowa ocena chromosomów za pomocą którejś z nowszych metod umożliwiła wykrywanie aneuploidii w ramach PGT-A, co przynosi korzyści w grupach ryzyka ⁹ . PGT-M należy oferować parom planującym rozród, u których w rodzinie występuje dziedziczna choroba na podłożu znanej lub dającej się wykryć nieprawidłowości genetycznej. Wykonywanie PGT-SR jest potencjalnie przydatne u osób ze znanymi rearanżacjami chromosomów rodzicielskich, takimi jak translokacja wzajemna, a zwłaszcza u par z nawracającymi poronieniami w wywiadach, pod warunkiem że od kobiety można pozyskać odpowiednią liczbę euploidalnych oocytów ⁹ .

PGT-A

Częstość występowania nieprawidłowości chromosomalnych zwiększa się wraz z wiekiem matki i stwierdza się je w ponad 30% klinicznie rozpoznanych ciąż u kobiet w wieku powyżej 40 lat ¹⁰ . W tej populacji korzyścią wynikającą z wykonania PGT-A jest umożliwienie oceny występowania aneuploidii w nadziei wyboru euploidalnego (chromosomalnie prawidłowego) zarodka do transferu ¹ . Korzyści z PGT-A mogą odnosić kobiety w wieku 35 lat lub starsze, a także pacjentki z wywiadami niepowodzenia implantacji lub nawracającego poronienia. Wybór i transfer euploidalnego zarodka zwiększa szansę implantacji i uzyskania ciąży ¹¹ .

Aneuploidia jest ważną przyczyną niepowodzeń cykli IVF i poronień, a częstość jej występowania – jak wspomniano wcześniej – zależy od wieku matki. Kiedy kobieta osiągnie 42 lata, częstość występowania aneuploidii u zarodków wzrasta do mniej więcej 80% ¹² . W badaniu, w którym oceniano częstość wykrywania aneuploidii u zarodków ocenianych metodami PGT-A, stwierdzono wzrost częstości występowania aneuploidii wraz z wiekiem matki – odsetek ten wyniósł: 46% u kobiet poniżej 35 roku życia, 54% u kobiet w wieku 35-37 lat, 63% u kobiet w wieku 38-40 lat, 66% u kobiet w wieku 41-42 lat oraz 54% u kobiet, które skończyły 42 lata ¹³ .

Mimo że PGT-A wydaje się atrakcyjną strategią diagnostyczną, to w dużej, wieloośrodkowej randomizowanej, kontrolowanej próbie klinicznej z udziałem kobiet w wieku 25-40 lat, u których do przesiewowej oceny wykorzystano platformę NGS, nie potwierdzono, aby zastosowanie tej metody zwiększyło częstość uzyskiwania utrzymujących się ciąż ¹⁴ . W analizie post hoc wykazano istotny wzrost częstości udanych ciąż tylko w kohorcie w wieku 35-40 lat. Wyboru zarodków tradycyjnie dokonuje się na podstawie oceny opartej na kryteriach morfologicznych, ale nie pozwala ona dokładnie przewidywać statusu chromosomalnego zarodków i ma pewne swoiste ograniczenia ¹⁵ . Obecnie stwierdza się istotne różnice między poszczególnymi ośrodkami ART pod względem klinicznych wyników stosowania PGT-A, co znajduje odzwierciedlenie w rozbieżnych publikowanych wynikach, więc nie uzgodniono jednolitego stanowiska w kwestii optymalnego przedziału wiekowego dla wykonywania PGT-A w kontekście formułowania zaleceń dotyczących praktyki klinicznej.

Ograniczenia PGT

Preimplantacyjne badania genetyczne nie są pozbawione ryzyka. Wszystkie rodzaje PGT opierają się na inwazyjnym zabiegu wykonywanym na rozwijającej się blastocyście, polegającym na chirurgicznej aspiracji komórek trofoektodermy (typowo 5-7 komórek) do dalszych analiz. Fakt, że po późniejszym przeniesieniu euploidalnego zarodka w ponad 30% przypadków nie udaje się uzyskać ciąży, a także istotna zmienność częstości powodzenia ciąż między różnymi laboratoriami wykonującymi PGT silnie przemawiają za potencjalną szkodliwością tego zabiegu.

Oprócz niejasności w kwestii tego, kto jest optymalnym kandydatem do PGT-A, dodatkowe problemy stwarza interpretacja wyniku. Istnieje możliwość mozaicyzmu zarodka z obecnością więcej niż jednej chromosomalnie odmiennej linii komórkowej w zarodku, w tym co najmniej jednej nieprawidłowej linii komórkowej, ale w przypadku utrzymujących się naturalnych ciąż dotyczy to tylko 1-2% zarodków ¹⁶ . Prawdziwy mozaicyzm wiąże się z większym ryzykiem niepowodzenia implantacji oraz poronienia. Znacznie większą częstość występowania mozaicyzmu obserwowano w przypadku PGT-A, zwłaszcza jeżeli stosuje się platformę NGS ¹⁷ . Opisywano wiele przypadków uzyskania ciąży i urodzenia zdrowego potomstwa po transferze zarodków ze stwierdzonym mozaicyzmem, co wskazuje, że taki wynik PGT-A może być artefaktem laboratoryjnym, a nie wyrazem prawdziwego mozaicyzmu ¹⁸ . Wydaje się, że to zjawisko jest następstwem zmienności liczby kopii w analizowanych chromosomach, co może stwarzać pozorne wrażenie mozaicyzmu, kiedy liczba kopii wykracza poza granice ustalone w algorytmie interpretacyjnym.

Dodatkowym czynnikiem zaburzającym ocenę może być to, że komórki typowo uzyskiwane z zewnętrznej warstwy trofoektodermy zarodka mogą nie być reprezentatywne dla wewnętrznej masy komórek zarodka, czyli okolicy, z której ostatecznie rozwija się płód. Zmienność podawanej częstości występowania mozaicyzmu może wynikać z: nierównego rozkładu takich komórek w obrębie zarodka, artefaktów testowania, błędów amplifikacji, zanieczyszczeń, zmienności techniki biopsji, a także z różnic w warunkach laboratoryjnych ¹⁹ . Kwestia, co robić z tymi tzw. mozaikowymi zarodkami, pozostaje nierozwiązanym problemem ośrodków ART i ich pacjentów, którzy zmagają się z decyzjami, czy takie zarodki przenosić, wyrzucać czy też czekać na bardziej rozstrzygające wskazówki ^{20, 21} .

PGT-M

Według ASRM preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku chorób jednogenowych ujawniających się w wieku dorosłym są etycznie dopuszczalne w przypadku różnych stanów, zwłaszcza kiedy dane schorzenie jest poważne i nie ma bezpiecznych oraz skutecznych metod interwencji ²² . PGT-M było pierwszym zastosowaniem PGT w 1989 roku, a obecnie można w ten sposób przesiewowo oceniać zarodki w kierunku ponad 1000 bardzo różnych dziedzicznych stanów i chorób, takich jak: mukowiscydoza, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, choroba Huntingtona, rdzeniowy zanik mięśni oraz nosicielstwo genów BRCA. Metodę tę można teoretycznie stosować w przypadku każdej choroby jednogenowej, w której jednoznacznie zidentyfikowano locus wywołujące chorobę. Zwykle takie badania są wykonywane po wystąpieniu choroby u dziecka osoby badanej lub jej bliskiego krewnego, ale coraz częściej pary chcą poddać się PGT-M po tym, jak oboje partnerów okazało się nosicielami genu choroby, kiedy przeprowadzono prenatalne badania przesiewowe z użyciem rozszerzonego panelu testów nosicielstwa, często przed planowaną ciążą. Wiele par woli wybrać zarodek bez genów choroby lub będący co najwyżej jej nosicielem, niż później polegać na inwazyjnej diagnostyce prenatalnej czy ryzykować wystąpienie choroby u dziecka.

W diagnostyce prowadzonej w ramach PGT-M nastąpił znaczny postęp od czasu wprowadzenia w latach 90. XX wieku pierwotnej technologii amplifikacji metodą PCR. Choroby jednogenowe, których warianty genetyczne są znane, mogą być przesiewowo wykrywane w ramach PGT-M poprzez celowaną amplifikację danego obszaru genomu, a następnie minisekwencjonowanie lub genotypowanie namnożonego produktu metodą qPCR, co pozwala znaleźć dany wariant genetyczny. Alternatywnie można do tego wykorzystywać kariomapowanie z użyciem mikromacierzy zawierających do 300 000 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) znajdujących się w obszarach rozrzuconych po całym genomie. Obecnie PGT-M wykonuje się zwykle metodą SNPa. Mikromacierz zawiera potencjalnie kilka milionów sond, czyli krótkich odcinków DNA, które umożliwiają przesiewową ocenę genotypu w zakresie setek tysięcy wybranych SNP ze wszystkich chromosomów podczas jednej reakcji. Jest to znacznie bardziej wydajne, ekonomiczne i dokładne rozwiązanie. PGT-M charakteryzuje się bardzo małą częstością błędów.

PGT-SR

Oszacowana częstość występowania zrównoważonych strukturalnych rearanżacji chromosomalnych wynosi mniej niż 1% w populacji ogólnej oraz około 6% u par z nawracającym poronieniem w wywiadach, ale stan ten może mieć katastrofalne konsekwencje dla potencjału reprodukcyjnego dotkniętych nim osób ²³ . Ryzyko niepłodności, poronień, urodzeń martwych oraz urodzenia dziecka z nieprawidłowością chromosomalną różni się znacznie w zależności od charakteru wykrytej rearanżacji strukturalnej (translokacja wzajemna lub robertsonowska, inwersja lub złożona rearanżacja chromosomalna). Przed zaplanowaniem PGT-SR niezbędne jest poradnictwo genetyczne. Obecnie PGT-ST wykonuje się typowo metodą aCGH, NGS lub SNPa.

Koszt PGT

Wiarygodność i efektywność kosztowa PGT-M oraz PGT-SR zostały dobrze ustalone. PGT-A jest efektywną kosztowo strategią diagnostyczną w przypadku zaawansowanego wieku matki, zwiększa wówczas prawdopodobieństwo powodzenia ciąży i zmniejsza ryzyko poronienia ¹³ . Stwierdzono, że po identyfikacji euploidalnego zarodka szanse na zajście w ciążę u kobiet w wieku powyżej 40 lat są takie jak u kobiet w wieku poniżej 30 lat. Dodatkowe korzyści postulowane w przypadku IVF z wykorzystaniem PGT-A w porównaniu z IVF bez takiej oceny obejmują: obniżenie łącznych kosztów w przeliczeniu na jedno żywe urodzenie, skrócenie czasu leczenia, redukcję liczby nieudanych transferów zarodka oraz zmniejszenie częstości występowania klinicznych poronień ¹³ . Wartość takiej diagnostyki u kobiet w wieku poniżej 30 lat nie została udowodniona. W przeszłości wykonywanie PGT zwiększało koszt cyklu IVF o 1000-4000 dol. w zależności od ośrodka ART, charakteru wykonywanych badań oraz liczby ocenianych zarodków. Nowsze technologie umożliwiające badanie wielu próbek z użyciem jednej mikromacierzy pozwalają jednak na istotne obniżenie tych kosztów.

Przyszłość

Preimplantacyjne badania genetyczne i związane z nimi technologie umożliwiły w krótkim czasie znacznie większy wgląd w skład genetyczny rozwijającego się zarodka, co potencjalnie pozwala na eliminację wielu nieuleczalnych chorób i poprawę ogólnej skuteczności zabiegów IVF. Każdy postęp, rozwiązujący określony problem diagnostyczny lub interpretacyjny, stwarza jednak nowe wyzwania, a nasze rozumienie zalet i ograniczeń poszczególnych metod wciąż ewoluuje. Można oczekiwać dalszego doskonalenia już stosowanych technologii, a ponadto opracowywane są też nowsze, nieinwazyjne metody wyboru zarodków, takie jak zastosowanie obliczeń metodami sztucznej inteligencji w połączeniu z mikroskopią poklatkową w celu określenia optymalnych markerów rozwoju zarodka, a także analiza pozakomórkowego DNA uwalnianego przez rosnący zarodek do zużytego podłoża hodowlanego ²⁴ .