Zastosowanie metody mikromacierzy tkankowych w onkologii

histopatologicznej w badaniach immunohistochemicznych (IHC), do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) oraz do hybrydyzacji in situ RNA. ^{2, 3, 8, 9, 18, 19} Jest szczególnie użyteczna do prowadzenia badań na dużych grupach przypadków i z licznymi przeciwciałami. ²⁰ Nie wykorzystuje się jej w celu ustalenia rozpoznania choroby nowotworowej, jednak jest ona coraz powszechniej stosowana w badaniach nad biologią nowotworów. ^{9, 11, 15, 20} Zgodność wyników badań wykonywanych klasyczną metodą histopatologiczną i metodą TMA wynosi 88-100 proc. ^{5, 21}

Za najistotniejsze jej zalety uznaje się redukcję kosztów w wyniku zużycia do badań znacząco mniejszych objętości przeciwciał, substancji pomocniczych i liczby szkiełek mikroskopowych, wykonywanie kolejnych odczynów immunohistochemicznych zawsze na precyzyjnie ustalonym i zawsze tym samym fragmencie guza oraz skrócenie czasu potrzebnego do przeprowadzenia badań. ^{3, 4, 9, 10, 14, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24} W badaniach z wieloma przeciwciałami ograniczenie pola oceny do 1-2 mm zawsze tego samego fragmentu tkanki czyni wyniki porównywalnymi i bardziej wiarygodnymi. ^{3, 4, 9, 14, 16, 23, 24} Cały proces wytwarzania pojedynczego bloku-biorcy TMA, obejmujący dwukrotną biopsję każdego z 20 bloków-dawców, przenoszenie bioptatów i umieszczanie ich w bloku-biorcy TMA, aż do skompletowania w nim 40 bioptatów o średnicy 2 mm, zajmuje około 2 godzin. ²¹ Gulmann i wsp. opisali konstrukcję bloku TMA utworzonego z 240 bioptatów o średnicy 0,6 mm w ciągu 6-8 godzin. ¹¹ Dla porównania doświadczonemu technikowi laboratoryjnemu skrojenie preparatów z 80 przypadków klasyczną metodą histopatologiczną i wykonanie w nich odczynów immunohistochemicznych zajmuje około 24 godzin. ¹¹

Wytwarzanie TMA

Podczas wytwarzania mikromacierzy tkankowych wyróżnić można kilka następujących po sobie etapów. W pierwszym z nich z odpowiednich bloków parafinowych zawierających badane tkanki, tzw. bloków-dawców (ang. donor block), wykonywane są preparaty mikroskopowe w celu znalezienia i zaznaczenia na preparacie miejsc najbardziej reprezentatywnych dla danego rozpoznania. ^{10, 13} W trakcie kolejnego etapu, z miejsc odpowiadających zaznaczonym obszarom na parafinowym bloku-dawcy pobierane są walcowate fragmenty tkankowe o średnicy od 0,6 mm do kilku mm, które następnie są umieszczane w odpowiednich co do średnicy otworach w gotowych blokach-biorcach TMA (ang. recipient block). ^{7, 13, 18} Bardzo istotne znaczenie ma układ bioptatów w bloku-biorcy TMA, który musi umożliwiać w sposób jednoznaczny identyfikację poszczególnych próbek tkankowych w preparacie mikroskopowym. ¹⁴ Pojedynczy blok-biorca TMA może zawierać tkanki od kilkudziesięciu do nawet kilkuset nowotworów. ^{9, 18} Ostatnim etapem jest zatopienie bloku-biorcy TMA w parafinie. Poprzeczne cięcie tak powstałego TMA pozwala uzyskać do 200 skrawków o grubości 4 µm zawierających tkanki zawsze z tych samych lokalizacji badanych guzów. Uzyskany metodą TMA pojedynczy skrawek umieszczony na szkiełku podstawowym jest barwiony i oceniany jako jeden preparat mikroskopowy. ^{8, 10, 14, 23} Proces wytwarzania bloku-biorcy TMA oraz przykładowe obrazy mikroskopowe uzyskiwane tą metodą zobrazowano na fot. 1-4.

Ryc. 2. Wytwarzanie mikromacierzy tkankowych: A – technika biopsji bloku-dawcy, B – pobrany bioptat przed umieszczeniem w bloku-biorcy, C – blok-biorca częściowo wypełniony bioptatami z bloku-dawcy, D – gotowy parafinowy blok-biorca (TMA).

Ryc. 3. A – preparat histologiczny z TMA (H+E), B – przykładowe rozmieszczenie poszczególnych bioptatów w bloku-biorcy, C + D – dwumilimetrowe bioptaty z tkankami gruczolakoraka

Ryc. 4. Obrazy mikroskopowe gruczolakoraka endometrium w metodzie TMA: A – bawienie H+E (powiększenie 400 x), B – silna ekspresja receptorów estrogenowych (powiększenie 200 x), C – silna ekspresja receptorów progesteronowych (powiększenie 200 x), D – silna ekspresja Ki67 (powiększenie 200 x).

Kontrowersje dotyczące stosowania metody TMA

Pomimo ciągłego doskonalenia metody TMA, niektóre problemy związane z jej stosowaniem nadal pozostają przedmiotem dyskusji. ^{3, 4, 6, 7, 25} Liczne kontrowersje towarzyszą reprezentatywności 1-2-mm fragmentów tkankowych w przypadkach nowotworów o zróżnicowanej budowie morfologicznej. ^{20, 26} Rozwiązaniem tej kwestii może być pobieranie większej liczby biopsji z bloku-dawcy lub zwiększenie średnicy pobieranych fragmentów tkankowych do co najmniej 3 mm. ^{11, 15, 26} W obu przypadkach ceną za poprawę efektywności metody TMA jest jednak większe uszkodzenie parafinowego bloku-dawcy. Nie można tego faktu bagatelizować, ponieważ w razie konieczności różnicowania wznowy nowotworu z guzem o podobnej strukturze histologicznej u tej samej chorej, przy braku materiału z pierwotnego rozpoznania, porównanie obu nowotworów nie jest możliwe. Obecnie przyjmuje się, że dwa do czterech bioptatów pobranych z bloku-dawcy i przeniesionych do bloku-biorcy TMA wystarczą do oceny morfologii guza nowotworowego. ^{2, 9, 10, 11, 15, 21, 27} Pogląd ten wydaje się słuszny, jednak przy założeniu, że pobrane bioptaty będą miały odpowiednią średnicę.

Średnica pobieranego bioptatu jest jednym z kluczowych czynników warunkujących reprezentatywność pobranego materiału w metodzie TMA. W sprzedaży komercyjnej znajdują się igły do biopsji parafinowych bloków-dawców o średnicy 0,6-5 mm. ^{4, 8, 11, 27} W piśmiennictwie dostępne są doniesienia mówiące o stosowaniu różnej średnicy igieł TMA w nowotworach ginekologicznych. ²⁷ Przykładowo, Fowler i wsp. wykonali mikromacierze tkankowe z 0,6-mm bioptatami do oceny ekspresji COX-2 i aromatazy w 336 przypadkach raka endometrium (różne typy histologiczne). ³ Z kolei Kim i wsp., podobnie jak ja, wykorzystali do produkcji TMA igły o średnicy 2 mm w grupie 332 chorych z rakiem szyjki macicy. ² Ci badacze, którzy preferują bioptaty o średnicy 0,6 mm jako wystarczające do oceny histopatologicznej, wskazują na korzyści ekonomiczne takiego rozwiązania. W pojedynczym tak skonstruowanym bloku TMA można bowiem umieścić nawet do kilkuset bioptatów o średnicy 0,6 mm. ^{13, 14, 22, 24, 27} Przeciwnicy stosowania tak małych średnic wskazują, że pobrany w ten sposób materiał z bloku-dawcy może nie być reprezentatywny dla całości nowotworu. ^{20, 26}

W piśmiennictwie szeroko dyskutowany jest problem utraty materiału tkankowego podczas wytwarzania TMA. Utrata materiału tkankowego rozumiana jako sytuacja, gdy materiał jest obecny w bloku-dawcy, a nie ma go na preparacie mikroskopowym przygotowanym z bloku-biorcy, jest szacowana przez różnych autorów na 3-30 proc. ^{4, 26, 28} Hernandez i wsp. wykonali TMA z 317 przypadków raka jelita grubego i odbytnicy z efektywnością wynoszącą 90,2 proc. ²⁹ Podobne wyniki uzyskali inni autorzy. ²⁰ Za jedną z przyczyn utraty materiału tkankowego podczas wytwarzania TMA uznaje się niską jakość parafinowego bloku-dawcy. ⁴ Uważa się, że jeżeli proces utrwalania tkanek pobranych operacyjnie trwał zbyt długo lub blok był zbyt wysuszony podczas przechowywania, istnieje znaczne ryzyko jego pęknięcia i w konsekwencji – nieodwracalnego uszkodzenia. ³⁰ Z kolei w przypadkach, gdy z bloku pobrano już uprzednio wiele wycinków i grubość tkanki w bloku jest niewielka, ilość materiału tkankowego może być niewystarczająca do uzyskania reprezentatywnego fragmentu tkankowego w TMA. ^{30, 31}

Niektórzy autorzy, w tym Kong i wsp. oraz Kajdacsy-Balla i wsp., proponują w takich przypadkach radiograficzną ocenę grubości bloków parafinowych dla danego przypadku i na tej podstawie dokonanie wyboru najbardziej odpowiedniego bloku-dawcy. ^{31, 32} Uważa się, że szczególnie gdy skrawki tkankowe są cienkie, ryzyko zbyt głębokiego lub zbyt płytkiego osadzenia bioptatu w bloku-biorcy znacząco wzrasta. ²¹ Gulmann i wsp. uważają, że gdy bioptaty osadzone są w bloku-biorcy na różnych głębokościach, tj. zbyt głęboko lub zbyt płytko, reprezentatywność tkanek w kolejnych następujących po sobie skrawkach może być różna. ¹¹ Należy zwrócić również uwagę na znaczenie wielkości obszaru zajmowanego przez nowotwór w bloku-dawcy. Gdy nowotwór zajmuje w nim mały obszar, identyfikacja odpowiedniego miejsca na bloku-dawcy i efektywne pobranie z niego materiału do wytworzenia TMA może być trudne lub wręcz niemożliwe. ²¹

Podsumowanie

Dotychczasowe obserwacje wskazują, że problemy towarzyszące konstrukcji TMA są nadal aktualne. Oznacza to dalsze starania, mające na celu poprawę efektywności metody oraz minimalizację uszkodzeń archiwalnego materiału histopatologicznego. ²⁸ Wprowadzenie gotowych parafinowych bloków-biorców TMA z otworami o średnicach 1-5 mm w miejsce trudnych do wykonania i nietrwałych bloków tworzonych przez samych badaczy było znaczące i potwierdziło, że ten kierunek działań jest możliwy i powinien być kontynuowany.