Biopsja mięśnia sercowego w diagnostyce kardiomiopatii

leczniczego w procesach zapalnych, a także do monitorowania potransplantacyjnego. Rozwój nanomedycyny, a tym samym medycyny spersonalizowanej, otwiera nową kartę w diagnostyce biopsyjnej mięśnia sercowego. Kluczowe znaczenie ma tutaj wykorzystanie nowych metod badawczych – takich jak mikroskopia elektronowa kriogeniczna – do oceny wycinków endomiokardialnych z następową personalizacją diagnostyki i leczenia.

Omówienie

Mija prawie 57 lat od wprowadzenia przez Sakakibarę i Konno do diagnostyki kardiologicznej procedury przezskórnej biopsji endomiokardialnej ¹ . Badanie to otworzyło nową kartę w przyżyciowej diagnostyce wielu schorzeń mięśnia sercowego, a także umożliwiło wprowadzenie biopsyjnego monitorowania serca po transplantacji tego narządu ² . Wzrastająca liczba procedur zarówno z dojścia przez żyłę szyjną wewnętrzną, jak i żyłę udową niosła ze sobą także ryzyko powikłań, których odsetek nie przekraczał jednak 1% bioptowanych przypadków. Wśród powikłań wymienia się perforację prawej komory, zaburzenia rytmu i przewodnictwa, odmę opłucnową, niedomykalność zastawki trójdzielnej oraz zatorowość płucną ³ . Niektóre ośrodki wykonują biopsję lewokomorową z dojścia przez tętnicę udową ⁴ , a tylko kilka z nich wykonuje biopsję obukomorową ^{5, 6} . Do tej grupy dołączyła także Polska, a dokładniej Klinika Elektrokardiologii Łódzkiego Uniwersytetu Medycznego, gdzie w 2016 roku rozpoczęto diagnostyczne wykonywanie obukomorowej biopsji mięśnia sercowego (pod kierunkiem dr. n. med. Krzysztofa Kaczmarka).

W związku z inwazyjnym charakterem badania, obserwowanymi powikłaniami, a także tzw. błędem próbki (patrz niżej) wskazania do biopsji endomiokardialnej uległy w ostatnich latach istotnemu ograniczeniu. Nie bez znaczenia był tutaj także rozwój technologiczny ukierunkowany na opracowanie coraz czulszych technik nieinwazyjnego badania serca ⁷ .

Jednym z głównych ograniczeń badania biopsyjnego serca był tzw. błąd próbki, wynikający z nietrafienia bioptomem na zmianę patologiczną. Pojęcie to odnoszone było przede wszystkim do diagnostyki ukierunkowanej na poszukiwanie zmian zapalnych mięśnia sercowego. Zmiany te mają charakter ogniskowy i przypadkowy, a ich lokalizacja jest często poza zasięgiem bioptomu. Ponadto istotnym czynnikiem obniżającym czułość biopsji endomiokardialnej było stosowanie do badania skrawków parafinowych wycinków mięśnia sercowego jedynie metod histochemicznych (hematoksylina i eozyna), na których opierała się historyczna klasyfikacja zapalenia mięśnia sercowego (ZMS), zwana klasyfikacją z Dallas ⁸ . Rozbieżności diagnostyczne w publikowanych badaniach opierających się na ocenie histochemicznej skrawków parafinowych wynosiły od 1 do 67% dodatnich rozpoznań ⁹ .

Wprowadzenie w latach osiemdziesiątych metod immunohistochemicznych do rutynowej oceny wycinków mięśnia sercowego, a także badań molekularnych (hybrydyzacja in situ, PCR) spowodowało podwyższenie czułości biopsji endomiokardialnej w diagnostyce ZMS ^{10, 11} . Metody immunohistochemiczne wykorzystujące przeciwciała skierowane przeciw określonym antygenom komórkowym umożliwiły zarówno precyzyjną charakterystykę komórkowego nacieku zapalnego, jak i ocenę ekspresji wielu antygenów białkowych, w tym obu klas układu HLA ¹² .

Obecnie podstawą diagnostyki biopsyjnej serca jest zintegrowana ocena wycinków na podstawie wyników trzech podstawowych technik badawczych: metod histochemicznych, immunohistochemicznych oraz metod detekcji elementów wirusowych (hybrydyzacja in situ, PCR). Należy tutaj dodać, że diagnostyka taka powinna być prowadzona przez doświadczony zespół badawczy. Jest to główny warunek uzyskania istotnych i niejednokrotnie rozstrzygających danych klinicznych. Reasumując, mimo wielu ograniczeń biopsja endomiokardialna pozostaje nadal kluczową metodą przyżyciowej oceny patologii mięśnia sercowego.

Podstawowe wskazania do wykonania diagnostyki biopsyjnej mięśnia sercowego ujęto w tabeli 1.

Biopsja endomiokardialna w kardiomiopatiach

Aktualna definicja kardiomiopatii określa je jako choroby mięśnia sercowego, w przebiegu których dochodzi do morfologicznego i czynnościowego uszkodzenia tkanek serca. Rozpoznanie kardiomiopatii musi być poprzedzone wykluczeniem innych znanych przyczyn rozwoju choroby, takich jak nadciśnienie tętnicze, choroba wieńcowa, nabyte wady zastawkowe czy wrodzone patologie serca. Niezależnie od typu kardiomiopatii wg klasyfikacji WHO z 1995 i American Heart Association z 2006 roku ¹³ głównymi wskazaniami do poszerzenia diagnostyki klinicznej o biopsję endomiokardialną w kardiomiopatiach jest podejrzenie etiologii zapalnej oraz infiltracyjno-spichrzeniowej (amyloidoza, sarkoidoza, choroba Fabry’ego).

Należy w tym miejscu podkreślić, że wszystkie dotychczasowe podziały kardiomiopatii są podziałami klinicznymi. Ocena morfologiczna serca niekoniecznie może korelować z parametrami klinicznymi kardiomiopatii. Najlepszym przykładem jest tutaj reakcja zapalna, która może towarzyszyć wszystkim rodzajom kardiomiopatii, zarówno tym pierwotnym, jak i wtórnym. Innym przykładem jest obecność w wycinkach chorych z kardiomiopatią nieniedokrwienną zmian niedokrwiennych, potwierdzonych także między innymi w pozytonowej tomografii emisyjnej ¹⁴ .

Podejrzenie ZMS w kardiomiopatiach pierwotnych i wtórnych

Tabela 2. Kliniczne postacie zapalenia mięśnia sercowego

Rycina 1A i B. Przewlekłe aktywne zapalenie mięśnia sercowego (ZMS) w badaniu immunohistochemicznym skrawków mrożeniowych. A. Silna, naczyniowa ekspresja antygenów HLA klasy I (A, B, C) z towarzyszącą stazą. B. Bardzo liczne uszkadzające nacieki makrofagalne (CD68+) z ogniskami martwicy kardiomiocytów

Rycina 1A i B. Przewlekłe aktywne zapalenie mięśnia sercowego (ZMS) w badaniu immunohistochemicznym skrawków mrożeniowych. A. Silna, naczyniowa ekspresja antygenów HLA klasy I (A, B, C) z towarzyszącą stazą. B. Bardzo liczne uszkadzające nacieki makrofagalne (CD68+) z ogniskami martwicy kardiomiocytów

Rycina 2. Eozynofilowe ZMS. Barwienie eozyną i hematoksyliną. Komórki olbrzymie (strzałki) w otoczeniu nacieków mieszanokomórkowych z przewagą leukocytów kwasochłonnych

Rycina 3. Eozynofilowe ZMS. Barwienie eozyną i hematoksyliną. Nacieki eozynofilowe (strzałki)

Diagnostyka ZMS jest podstawowym wskazaniem do wykonania biopsji serca u chorego z klinicznym rozpoznaniem kardiomiopatii, znajdującym się w I klasie rekomendacji towarzystw kardiologicznych ¹⁵ . Rozważając wykonanie biopsji endomiokardialnej, należy wziąć pod uwagę zarówno kliniczny obraz tego schorzenia (tab. 2), jak i

• krótki wywiad chorobowy w kierunku niewydolności serca (NS) (<2 tygodni) zarówno przy prawidłowej, jak i poszerzonej lewej komorze, poprzedzony niejednokrotnie obecnością czynnika infekcyjnego w wywiadzie (klasa rekomendacji IB)
• krótki wywiad chorobowy NS (<12 tygodni) z towarzyszącym blokiem przedsionkowo-komorowym II lub III°, a także powstałymi de novo komorowymi zaburzeniami rytmu serca (klasa rekomendacji IB)
• krótki wywiad chorobowy w kierunku NS ze współistniejącymi reakcjami alergicznymi (astma) (klasa rekomendacji IIA).

Badania własne autorów wskazują, że powinno się także rozważyć wykonanie biopsji endomiokardialnej w przypadku postępującej NS mimo optymalizacji terapii. W tych przypadkach istnieje duże prawdopodobieństwo rozwinięcia się lub utrzymywania przewlekłego ZMS z obrazem klinicznym kardiomiopatii rozstrzeniowej ¹⁶ . Należy zaznaczyć, że kryteria przewlekłego ZMS nie zostały jak do tej pory ustandaryzowane ze względu na jego różnorodność histologiczną i rozbieżne stanowiska patologów. Autorzy monografii opracowali i posiłkują się własną klasyfikacją, tzw. klasyfikacją ZABRZE, dzielącą przewlekłe ZMS na zapalenie przewlekłe aktywne i przewlekłe przetrwałe ¹⁷ . Podział ten, oparty na diagnostyce immunohistologicznej, ułatwia podjęcie decyzji dotyczącej wdrożenia terapii immunosupresyjnej u chorych z aktywną formą ZMS (ryc. 1A i B). Skuteczność tej terapii w grupie chorych z wykładnikami przewlekłej aktywnej reakcji zapalnej potwierdzono w randomizowanym badaniu własnym ¹⁸ . Podobne randomizowane badanie z udziałem chorych z limfocytarnym ZMS przy ujemnym wyniku badania wirusowego jest obecnie realizowane przez szpital akademicki w Brnie w Czechach ¹⁹ .

Kluczowe znaczenie dla szybkiego wdrożenia kilkuskładnikowej terapii immunosupresyjnej ma wykazanie obecności w biopsji endomiokardialnej ostrego ZMS z występowaniem komórek wielojądrzastych (olbrzymich) (ryc. 2). Czułość biopsji endomiokardialnej w odniesieniu do olbrzymiokomórkowego ZMS wynosi 80-85% z dobrym wynikiem leczenia immunosupresyjnego w tej grupie chorych ^{20, 21} .

Nie mniej istotne znaczenie w aspekcie ww. terapii ma także wykazanie w bioptatach nacieków eozynofilowych (ryc. 3). Obecność eozynofili w mieszanokomórkowym nacieku zapalnym występuje w:

• eozynofilowym ZMS (zespół Löfflera)
• ostrym eozynofilowym ZMS z martwicą naczyń (zespół Churga-Strauss)
• eozynofilowym ZMS z nadwrażliwości
• odczynach eozynofilowych w mięśniu sercowym w przebiegu infestacji pasożytniczych.

Mimo dominującej obecności eozynofili w wycinkach serca każda z ww. jednostek chorobowych ma wyróżniające ją cechy histologiczne. W przypadku badań biopsyjnych ze względu na małą ilość badanego materiału tkankowego rozpoznanie może jednak nastręczać wiele trudności.

Rycina 4. Obraz histologiczny arytmogennej dysplazji prawej komory. Barwienie eozyną i hematoksyliną

Dodatkowym wskazaniem do diagnostyki biopsyjnej jest kliniczne podejrzenie arytmogennej dysplazji prawej komory. W wycinkach biopsyjnych pobranych z przegrody od strony prawej komory dominuje w tych przypadkach tkanka tłuszczowo-włóknista (ryc. 4).

Niezwykle rzadko wykonuje się biopsję endomiokardialną u chorych z kardiomiopatią przerostową. Własne doświadczenia autorów wskazują jednak, że biopsja u tych pacjentów może być pomocna w kwalifikacji do przeszczepu serca, a także pozwalać na wykluczenie współistniejącej reakcji zapalnej jako potencjalnej przyczyny progresji choroby w kierunku formy rozstrzeniowej.

Kardiomiopatia rozstrzeniowa jest najczęstszą postacią kliniczną zapalenia mięśnia sercowego. Jest ona także najczęstszym wskazaniem do wykonania biopsji mięśnia sercowego po uwzględnieniu aktualnych wytycznych w tym względzie ¹⁵ .

Podejrzenie obecności zmian infiltracyjnych we wtórnych kardiomiopatiach restrykcyjnych

Rycina 5. Podział kliniczny kardiomiopatii restrykcyjnych

Kardiomiopatie restrykcyjne stanowią szeroką grupę schorzeń obejmujących zarówno zmiany w mięśniu sercowym, jak i we wsierdziu (ryc. 5). W grupie tej znajduje się zarówno kardiomiopatia restrykcyjna pierwotna typu mieszanego (idiopatyczna), jak i cała grupa wrodzonych i nabytych kardiomiopatii wtórnych ²² . Ich dominującą cechą kliniczną jest dysfunkcja rozkurczowa restrykcyjna w badaniu echokardiograficznym przy jednoczesnym zachowaniu funkcji skurczowej. Podejrzenie kardiomiopatii restrykcyjnej z nacieczeniem kwalifikuje chorego do diagnostyki biopsyjnej. Dotyczy to głównie przypadków podejrzenia:

• amyloidozy serca
• sarkoidozy serca.

Amyloidoza serca jest coraz częściej rozpoznawaną przyczyną niejasnej etiologicznie NS. Jest chorobą zarówno nabytą, jak i mającą podłoże genetyczne. Wykazano jak do tej pory 11 różnych białek odkładających się w sercu w formie amyloidu ²³ . Statystycznie najczęściej (80% przypadków) obserwuje się złogi łańcuchów lekkich (amyloidoza AL), a następnie transtyretyny (amyloidoza ATTR, 18% przypadków). W wycinkach mięśnia sercowego transtyretyna wykrywana jest jednak najczęściej ²⁴ . Potwierdzają to także badania własne autora. Ten typ amyloidozy występuje w formie nabytej („wild type") i wrodzonej, związanej z mutacjami w genie transtyretyny. Ze względu na pogrubienie przegrody międzykomorowej w następstwie odkładania się depozytów amyloidu (głównie w jej części tylno-podstawnej) choroba ta często wykazuje cechy kardiomiopatii przerostowej.

Rycina 6. Dodatnie barwienie histochemiczne czerwienią Kongo wycinków mięśnia sercowego na obecność złogów amyloidu (strzałki)

Rycina 7. Obecność włókienek amyloidozy transtyretynowej (strzałki) w wycinkach mięśnia sercowego w badaniu w mikroskopie elektronowym

Najbardziej rozpowszechnioną metodą histochemiczną pozwalającą na potwierdzenie obecności amyloidu jest barwienie histochemiczne czerwienią Kongo (ryc. 6). Techniki immunohistochemiczne umożliwiają natomiast typowanie amyloidu, będące podstawą odpowiedniego postępowania leczniczego. Transmisyjna mikroskopia elektronowa umożliwia wykazanie zagregowanych filamentów amyloidu o długości 7-10 nm (ryc. 7). Planując diagnostykę biopsyjną amyloidozy, należy uwzględnić zabezpieczenie 1 wycinka do badania w mikroskopie elektronowym (utrwalanie w 2,5-3% glutaraldehydzie w buforze kakodylowym/fosforanowym). Algorytm postępowania przy podejrzeniu amyloidozy serca przedstawiono w monografii poświęconej kardiomiopatii restrykcyjnej ²² .

Sarkoidoza serca jest wielonarządową chorobą o nieustalonej etiologii, cechującą się tworzeniem w narządach ziarniniaków bez towarzyszących zmian martwiczych. Zwykle obserwuje się także obecność komórek olbrzymich. Z tego powodu sarkoidozę różnicuje się z olbrzymiokomórkowym ZMS. Występowanie wysoce zorganizowanych ziarniniaków wraz z towarzyszącym włóknieniem jest cechą patognomoniczną sarkoidozy. Jednak zaledwie u 25% chorych z kardiomiopatią rozstrzeniową i rozpoznaną klinicznie sarkoidozą udaje się w materiale biopsyjnym wykazać ich obecność ²⁵ . Jest to związane z preferencyjną lokalizacją ziarniniaków w miokardium, następnie epikardium, a dopiero na końcu w endokardium dostępnym biopsyjnie. Klinicznie sarkoidoza serca zwykle przebiega pod postacią NS z towarzyszącymi zaburzeniami rytmu i przewodnictwa ²⁶ . Z uwagi na dobrą odpowiedź choroby na leczenie immunosupresyjne biopsja endomiokardialna stanowi istotny element jej diagnostyki.

Podejrzenie obecności zmian spichrzeniowych we wtórnej kardiomiopatii restrykcyjnej

Kardiomiopatie restrykcyjne o podłożu spichrzeniowym są kardiomiopatiami uwarunkowanymi genetycznie, w przebiegu których obserwuje się wielonarządowe objawy kliniczne. Mutacje genowe mogą być zarówno jedno- (choroba Fabry’ego, choroba Gauchera), jak i wielowariantowe (choroba Niemanna-Picka). Głównym wskazaniem do diagnostyki biopsyjnej mięśnia sercowego jest choroba Fabry’ego. Jest to schorzenie związane z mutacją genu dla lizosomalnego enzymu α-galaktozydazy A, zlokalizowanego w chromosomie X. Skutkiem mutacji jest gromadzenie się glikosfingolipidów w lizosomach kardiomiocytów i ich stopniowa degeneracja. Degeneracja ta charakteryzuje się występowaniem nasilonej wakuolizacji komórek mięśniowych, jednak zmiany te są niespecyficzne i występują także w przewlekłych zmianach niedokrwiennych. Niezwykle pomocne okazuje się tutaj badanie wycinków w mikroskopie elektronowym, pozwalające na wykazanie obecności figur mielinowych w kardiomiocytach i komórkach śródbłonka naczyniowego.

Klinicznie choroba Fabry’ego przypomina kardiomiopatię przerostową ²⁷ . Uważa się, że u około 3% mężczyzn z niejasnym etiologicznie przerostem mięśniówki lewej komory można rozpoznać homozygotyczną postać choroby Fabry’ego ²⁸ . Od 2001 roku dostępna jest terapia substytucyjna rekombinowaną α-galaktozydazą (aglazydaza β). Po włączeniu leczenia kontrolna biopsja mięśnia sercowego jest wykorzystywana jako cenne narzędzie oceny odpowiedzi na lek ²⁹ .

Diagnostyka biopsyjna w innych kardiomiopatiach wtórnych

Wśród wielu kardiomiopatii wtórnych typowanych do diagnostyki biopsyjnej na szczególną uwagę zasługują dwie z nich:

• kardiomiopatia antracyklinowa
• hemochromatoza.

Kardiomiopatia antracyklinowa jest następstwem zastosowania wielu leków z grupy antracyklinowej (doksorubicyna, daunorubicyna). Uszkodzenie miokardium zależy od wielkości dawki, a także od indywidualnej wrażliwości na te leki. Klinicznie kardiomiopatie antracyklinowe mogą przyjmować postać zarówno kardiomiopatii rozstrzeniowej, jak i restrykcyjnej. Uszkodzenie serca może mieć postać ostrej lub przewlekłej NS, pojawiającej się nawet po kilku latach od zaprzestania przyjmowania leków. Biopsja mięśnia sercowego jest traktowana jako najczulszy i specyficzny test uszkodzenia poantracyklinowego serca ³⁰ . W ocenie histologicznej w wycinkach dominuje włóknienie zarówno śródmiąższowe, jak i zastępcze bez współistniejących cech przerostu kardiomiocytów. Jednak aby wykazać najwcześniejsze zmiany patologiczne, należy wykonać badanie elektronomikroskopowe wycinków tkankowych serca. Zgodnie z aktualnymi wskazaniami do biopsji endomiokardialnej diagnostyka biopsyjna powinna być rozważana w przypadku pojawienia się kardiomiopatii u leczonego chorego w kontekście możliwości utrzymania lub zwiększenia dawki leku ¹⁵ .

Hemochromatoza może być schorzeniem zarówno nabytym (liczne transfuzje krwi), jak i wrodzonym (mutacja genowa), występującym w następstwie gromadzenie się jonów żelaza w kardiomiocytach. Skutkiem tego jest rozwój niewydolności lewokomorowej serca. Do wykazania złogów żelaza w wycinkach endomiokardialnych wykorzystuje się barwienie histochemiczne błękitem pruskim ³¹ .

W pozostałych przypadkach kardiomiopatii pierwotnych i wtórnych należy kierować się indywidualnymi wskazaniami do takiej diagnostyki.

Podsumowanie

Biopsja endomiokardialna pozostaje ważnym, niekiedy rozstrzygającym narzędziem diagnostycznym w chorobach mięśnia sercowego. W ostatnich kilku latach daje się zauważać ponowny wzrost znaczenia tego narzędzia diagnostycznego, szczególnie w aspekcie poszukiwania nowych wskaźników patologii mięśniowej, a także nowych sposobów postępowania leczniczego. W ten nurt wpisują się też badania autorów ³² , ukierunkowane na poszerzenie panelu diagnostyczno-badawczego o nowe markery schorzeń mięśnia sercowego. Celowi temu będzie także służyło budowane właśnie w Zabrzu Śląskie Laboratorium Nanomikroskopii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. Nowoczesne techniki badawcze (mikroskopia elektronowa, w tym reżimu kriogenicznego, mikroskopia sił atomowych, mikroskopia holograficzna czy mikroskopia konfokalna wysokiej rozdzielczości) umożliwią, w opinii autorów, osiągnięcie innego poziomu oceny histologicznej zmierzającej do personalizacji diagnostyki i leczenia schorzeń mięśnia sercowego.

Na potrzeby niniejszego artykułu przyjęto podział kardiomiopatii wg American Heart Association z 2006 roku