Diagnostyka konfliktów płytkowych

antygenowi RhD obecnemu na krwinkach czerwonych prowadzą do niszczenia tych komórek i choroby hemolitycznej płodu i noworodka ale, w przeciwieństwie do konfliktu Rh, dotyczy płytek, a nie krwinek czerwonych i może występować już w pierwszej ciąży. Jego częstość oceniana jest na 1/1000-2000 żywo urodzonych dzieci. Śmiertelność jest duża: około 10% dotkniętych nim płodów/noworodków umiera w wyniku krwawienia do ośrodkowego układu nerwowego (OUN).

W Polsce przeprowadzono prospektywne badania, które stanowią potwierdzenie danych światowych dotyczących częstości AIMP/N. ^{1, 2} W latach 1994-97 oceniono liczbę płytek u ponad 26 000 ciężarnych i ponad 24 000 urodzonych przez nie noworodków. Małopłytkowość wykryto u 0,5% matek i u 0,7% noworodków. Częstość małopłytkowości, spowodowanej przeciwciałami przeciwpłytkowymi, wynosiła ~1/2000 urodzonych dzieci. Dodatkowo u 2 kobiet, które urodziły dzieci z małopłytkowością, nie wykryto przeciwciał, ale stwierdzono, że między matką a dzieckiem występuje konflikt płytkowy – dziecko ma antygen płytkowy, którego nie ma matka.

Objawy AIMP/N

W AIMP/N obserwuje się szeroki zakres objawów klinicznych. ^{3, 4, 5, 6} Najczęstszymi są wybroczyny oraz wylewy skórne i śluzówkowe u noworodka w pierwszych godzinach życia lub u płodu. AIMP/N może też przebiegać bez żadnych objawów klinicznych lub objawiać się jedynie bardzo umiarkowaną małopłytkowością. Zdiagnozowanie AIMP/N jest w takich przypadkach istotne dla kolejnych ciąż, ponieważ wykazano, że zarówno stopień małopłytkowości, jak i objawy kliniczne w kolejnych ciążach u kobiet, u których wykryto przeciwciała przeciwpłytkowe, się nasilają. Najgroźniejsze są przypadki, w których dochodzi do krwotoku wewnątrzczaszkowego (ICH). Może on wystąpić już w życiu płodowym. Dlatego diagnostyka w kierunku AIMP/N powinna być prowadzona w przypadkach zaobserwowania zmian wskazujących na ICH w obrazie USG płodu.

Diagnostyka

Diagnostykę AIMP/N należy rozpocząć od wykluczenia innych przyczyn małopłytkowości, takich jak posocznica, martwicze zapalenie jelit (NEC), rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC), niewydolność łożyska, wrodzone zakażenia, zamartwica, małopłytkowość immunologiczna u matki. ^{6, 7} Należy też wykluczyć tzw. pseudotrombocytopenię, czyli artefakt – obserwowany tylko in vitro, gdy zmniejszona liczba płytek w badanej próbce wynika z obecności przeciwciał zależnych od wersenianu sodu (EDTA) używanego jako antykoagulant. ⁸ Powtórzenie badania z próbki krwi pobranej na inny antykoagulant pozwala wykluczyć małopłytkowość. Należy podkreślić, że AIMP/N może towarzyszyć każdej małopłytkowości wywołanej innymi przyczynami.

Diagnostykę najczęściej prowadzi się po urodzeniu (tab. 1), gdy u noworodka wystąpi wylew do OUN lub obserwuje się u niego wybroczyny/krwawienia, zbyt duży krwiak w miejscu wstrzyknięcia lub rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe. Diagnostykę przed lub w czasie ciąży wdraża się wtedy, gdy u wcześniej urodzonego rodzeństwa zdiagnozowano AIMP/N. Prowadzi się ją też u sióstr kobiet z konfliktem płytkowym. Jest bowiem prawdopodobne, że może im zagrażać konflikt płytkowy o tym samym podłożu.

Ważne jest prowadzenie diagnostyki, jeśli wyniki USG płodu wskazują na wylew do ośrodkowego układu nerwowego lub na wodogłowie. Wskazane jest też przeprowadzenie diagnostyki w przypadkach nawracającej utraty płodu, ponieważ szacunki częstości AIMP/N odnoszą się do dzieci żywo urodzonych.

Tabela 1. Diagnostyka i badania przeglądowe w kierunku konfliktów płytkowych i alloimmunologicznej małopłytkowości płodów i noworodków

Tabela 2. Określenie antygenów u matki, ojca, dziecka i płodu*

Małopłytkowość wynikająca z alloimmunizacji może być przyczyną zagrażającego utratą płodu krwawienia w czasie wykonywania kordocentezy diagnostycznej, dlatego u kobiet, u których planowany jest taki zabieg, powinno być wykonane badanie w kierunku najpowszechniej występującego konfliktu w układzie HPA1.

Zdiagnozowanie konfliktu płytkowego jest ważne nie tylko dla obecnej, ale i przyszłej ciąży. Konflikt płytkowy może bowiem nie prowadzić do małopłytkowości u płodu w obecnej ciąży, ale następna ciąża jest zagrożona ciężką AIMP/N.

Udział antygenów obecnych na płytkach w patogenezie AIMP/N

Najczęstszą przyczyną wystąpienia alloimmunologicznej małopłytkowości u płodu i noworodka są swoiste przeciwciała przeciw antygenom płytek (human platelet antigens, HPA), a spośród nich przeciwciała przeciwko antygenowi HPA1a. Antygeny HPA ulegają ekspresji na komórkach płodu już w 16-18 tygodniu ciąży i w przypadku, gdy antygeny płodu są niezgodne z antygenami matki, mogą być przez jej układ immunologiczny rozpoznane jako obce. Wytworzone przeciwciała mogą doprowadzić do niszczenia płytek płodu już w czasie ciąży.

Do chwili obecnej wykryto aż 27 swoistych antygenów płytek. Wszystkie antygeny HPA odkryto, ponieważ spowodowały alloimmunologiczną małopłytkowość u płodu lub noworodka. Jest to 12 antygenów dwuallelicznych (HPA1a/b – 5a/b i HPA15a/b), z których antygen oznaczony literą a często występuje w populacji kaukaskiej, a antygen oznaczony literą b – występuje rzadko w tej populacji. Dodatkowo opisano 15 antygenów rzadko występujących w populacji HPA6b-14b, 16b-21b. Odkryto je, ponieważ ich obecność na płytkach płodu spowodowała alloimmunizację (wytworzenie przeciwciał) przez ciężarną. W trakcie diagnostyki takich przypadków stwierdza się, że przeciwciała obecne u matki reagują wyłącznie z płytkami ojca dziecka i z płytkami dziecka. W toku dalszych badań ustalane jest, przeciwko jakiej glikoproteinie płytek ojca skierowane są wykryte przeciwciała. Dokonanie analizy sekwencji kodującej daną glikoproteinę w DNA ojca i ustalenie różnic w sekwencji w porównaniu do dotychczas poznanych alleli prowadzi do odkrycia nowego antygenu.

Dyskusyjny jest udział antygenów HLA w patogenezie alloimmunologicznej małopłytkowości płodów i noworodków. ^{9, 10} Jak wiadomo, przeciwciała te występują u ciężarnych ze znaczną częstością – wykrywane są u blisko połowy wieloródek. Wątpliwości dotyczące ich udziału w patogenezie AIMP/N wynikają z faktu, że te przeciwciała są adsorbowane przez wolnokrążące antygeny HLA i przez łożysko, a ich ekspresja na komórkach noworodka jest słaba. Dodatkowo wiązanie się przeciwciał anty-HLA do makrofagów płodu osłabia ich udział w niszczeniu płytek. Bardzo wątpliwy jest też udział antygenów układu ABO w patogenezie AIMP/N, bo antygeny te późno ulegają ekspresji.

Metody diagnostyczne AIMP/N

W zakres badań diagnostycznych w konflikcie płytkowym wchodzi: określanie antygenów HPA u matki, ojca, dziecka (ewentualnie płodu) i badanie przeciwciał.

Określanie antygenów u matki, ojca, dziecka i płodu wykonuje się, wykorzystując metody serologiczne oraz analizę DNA (tab. 2). Do badań serologicznych wykorzystuje się przeciwciała skierowane przeciw poszczególnym antygenom płytek. Są one trudne technicznie i mają wiele ograniczeń wynikających przede wszystkim z braku surowic diagnostycznych zawierających swoiste przeciwciała czy niedostatecznej liczby płytek do badań, jak w przypadku osób z małopłytkowością. Dlatego badania serologiczne uzupełnia się (w przypadku najcięższego konfliktu w układzie HPA1) lub nawet zastępuje (w pozostałych konfliktach) badaniami molekularnymi. Te badania stosowane są w Polsce od lat 90. XX wieku. ^{11, 12} Niewątpliwą zaletą badań serologicznych jest wykrywanie dzięki nim antygenu znajdującego się faktycznie na płytkach.

Metodami molekularnymi badamy DNA kodujący sekwencje aminokwasów w białkach, które są nośnikami antygenów płytkowych i na tej postawie wnioskujemy o obecności antygenu. Materiałem do badań jest na ogół krew obwodowa, ale badanie może być też wykonane praktycznie z każdego materiału, w którym znajduje się DNA, czyli komórki jądrzaste. Może to być materiał pobrany podczas kordocentezy i amniopunkcji, a także z wszelkich wymazów z jam ciała. Niezwykle istotny jest sposób pobierania materiału, aby nie spowodować wzajemnego zanieczyszczenia próbek. Małopłytkowość nie stanowi czynnika ograniczającego wykonanie badania na poziomie DNA. Jest to bardzo istotne, bo u osób z małopłytkowością liczba płytek jest za mała, aby wykonać badanie metodami serologicznymi. Wiarygodność wyniku badania genetycznego jest duża, ale istnieje niewielkie prawdopodobieństwo (ok. 1:1000) wystąpienia u badanej osoby polimorfizmu (występowanie „nietypowego nukleotydu” – innego niż u większości ludzi w populacji) w analizowanych fragmentach DNA, co spowoduje wynik fałszywy.

Badania molekularne cechują się bardzo wysoką czułością i w niedalekiej perspektywie będą mogły być wykorzystane do nieinwazyjnego określania HPA płodu z osocza ciężarnej. Takie badanie jest niezwykle istotne w przypadku występowania u kobiety swoistych przeciwciał przeciwpłytkowych. Przeciwciała te nie są groźne dla płodu, jeśli nie odziedziczył on od ojca niezgodnego antygenu, przeciwko któremu skierowane są przeciwciała obecne u matki.

Badania przeciwciał w diagnostyce AIMP/N

Wykrycie przeciwciał przeciwpłytkowych i określenie ich swoistości jest niezwykle ważne dla diagnostyki konfliktu. Badania wykonuje się za pomocą różnych testów, by zwiększyć prawdopodobieństwo ich wykrycia, ponieważ pewne przeciwciała wykrywane są tylko w niektórych testach (tab. 3). Testami stosowanymi w diagnostyce AIMP/N są: immunofluorescencji z płytkami, immunoenzymatyczny ELISA z glikoproteinami będącymi nośnikami antygenów płytek, MAIPA z użyciem monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko glikoproteinom płytkowm. Ten ostatni stanowi złoty standard w diagnostyce AIMP/N. ^{1, 2, 5, 12} Metody wykrywania przeciwciał są nieustannie modyfikowane i możemy się spodziewać, że niebawem stosowane będą testy oparte na nowych technologiach. ^{13, 14}

Tabela 3. Badania przeciwciał wykorzystywane w diagnostyce AIMP/N

Ważnym etapem diagnostyki jest wykazanie reaktywności przeciwciał w stosunku do płytek izolowanych od ojca dziecka. W przypadkach, w których przeciwciała nie reagują z płytkami dawców panelowych, a reagują tylko z płytkami ojca, istnieje podejrzenie, że u ojca występuje antygen bardzo rzadko spotykany i należy wdrożyć diagnostykę w kierunku identyfikacji tego antygenu.

Po wykryciu przeciwciał należy ustalić ich swoistość. Badanie wykonuje się z panelem dawców o oznaczonych antygenach HPA lub z glikoproteinami o określonej swoistości. W piśmiennictwie dyskutowana jest wartość ilościowego badania przeciwciał dla przewidywania ciężkości konfliktu – dla ustalania zagrożenia małopłytkowością. Wielu autorów wskazuje, że takie badanie jest przydatne.

Badanie przeciwciał najczęściej, jak powiedziano wyżej, wykonuje się po ciąży podczas diagnostyki dziecka z małopłytkowością. Ma ono duże znaczenie dla kolejnej ciąży, w której można zastosować odpowiednie leczenie. Należy podkreślić, że przeciwciała mogą nie być wykryte u niektórych kobiet z konfliktem płytkowym z powodu ich małego stężenia. Mogą one być wykrywalne dopiero po kilku tygodniach po porodzie lub dopiero w następnej ciąży. Wykrycie przeciwciał jest więc ważne, ale ich niewykrycie nie przesądza o wykluczeniu AIMP/N.

Kobiety, których dzieci miały objawy sugerujące AIMP/N, u których nie wykryto przeciwciał, ale wykryto niezgodność w antygenach HPA, muszą być kierowane na diagnostykę w kierunku AIMP/N w kolejnej ciąży.

Należy też brać pod uwagę, co powiedziano wyżej, że przeciwciała nie są groźne dla płodu i nie spowodują małopłytkowości wtedy, gdy płód nie odziedziczył niezgodnego antygenu. Stwierdzić to można obecnie jedynie, wykonując kordocentezę, aby zbadać liczbę płytek i ich antygeny. Ocena antygenów jest możliwa za pomocą metod analizy DNA. Zabieg kordocentezy w przypadkach małopłytkowości u płodu jest wysoce inwazyjny. Z tej przyczyny bardzo duże nadzieje wiąże się z wprowadzeniem nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej w AIMP/N, pozwalającej na ustalenie, jakie antygeny ma płód, ponieważ przeciwciała mogą pochodzić z poprzedniej ciąży, a nie są groźne dla płodu. Takie badania są obecnie opracowywane w Polsce. Są one trudniejsze technicznie od nieinwazyjnych badań antygenu RhD, ponieważ u podłoża molekularnego przeciwstawnych antygenów płytkowych leży różnica tylko jednego nukleotydu w sekwencji kodującej w DNA matki i DNA płodu. Standaryzacja takich badań jest bardzo trudna i pracochłonna, a można jej dokonać jedynie na materiale pochodzącym od ciężarnych z konfliktem w HPA.

Konflikt w układzie HPA1 – najczęstsze podłoże AIMP/N

Podłożem AIMP/N jest najczęściej konflikt w układzie HPA1 wtedy, gdy kobieta nieposiadająca antygenu HPA1a (HPA1a ujemna, czyli HPA1bb) wytwarza przeciwciała przeciw antygenowi HPA1a, który płód odziedziczył od ojca. Konflikt ten leży u podłoża około 80-85% AIMP/N. Osoby HPA1bb stanowią około 2% w populacji kaukaskiej, a więc 2% ciężarnych jest potencjalnie narażonych na ten konflikt płytkowy. Około 74% populacji stanowią osoby heterozygotyczne HPA1ab, pozostałe 24% to homozygoty HPA1aa. Jeśli ojciec dziecka ma fenotyp HPA1aa, to każde jego dziecko „będzie w konflikcie” z HPA1a ujemną matką; jeśli jest heterozygotą to istnieje 50% szans, że dziecko nie odziedziczy niezgodnego antygenu. Określanie antygenów lub genotypu ojca ma więc istotne znaczenie dla wnioskowania o zagrożeniu konfliktem u kobiet HPA1bb (czyli HPA1a ujemnych). Niezgodność antygenu HPA1a występuje w około 1 na 350 ciąż. Nie we wszystkich z nich dochodzi do wytworzenia przez kobietę przeciwciał anty-HPA1a. Duże znaczenie rokownicze wskazujące na ryzyko alloimmunizacji ma badanie występowania u kobiety antygenu HLA DRB3*0101. ^{15, 16} Wykazano, że jeśli u kobiety nie występuje antygen HLA DRB3*0101, to nie wytworzy przeciwciał anty-HPA1a. W Polsce przeprowadzono badania antygenów HPA1a metodą ELISA u 8013 ciężarnych. ^{17, 18} Zidentyfikowano 144 (1,8%) kobiety HPA1a ujemne (bb). Przeciwciała anty-HPA1a wykryto u 12/122 (9,8%; 1/667 ciąż). Połowa zimmunizowanych była w pierwszej ciąży. Wszystkie kobiety z przeciwciałami były DRB3*0101 dodatnie. Ale antygen ten stwierdzono też u 29% kobiet niezimmunizowanych. Alloimmunologiczną małopłytkowość płodu lub noworodka obserwowano w 10/12 przypadków, u dwojga dzieci małopłytkowość nie wystąpiła, bo nie odziedziczyły one od ojca niezgodnego antygenu (były takie jak matka HPA1bb). Głęboka małopłytkowość wystąpiła u 4/12 dzieci (33%) urodzonych przez matki z przeciwciałami.

Przeglądowe badania antygenów układu HPA1 pozwalające na wykrycie zagrożenia najczęstszym i najpoważniejszym konfliktem płytkowym

Biorąc pod uwagę, że najczęstszym podłożem AIMP/N są przeciwciała przeciwko antygenowi HPA1a wytwarzane przez kobiety HPA1a ujemne (czyli HPA1bb) i że w około 1/1000 ciąż te przeciwciała mogą prowadzić do AIMP/N, rozważa się na świecie wprowadzenie przeglądowych badań antygenu HPA1a u ciężarnych. Badania takie wprowadzono w Norwegii. ¹⁹ Identyfikują one kobiety zagrożone konfliktem w HPA1a. Ciąże u kobiet HPA1bb są monitorowane w kierunku AIMP/N (tab. 4).

Tabela 4. Badania przeglądowe w celu identyfikacji kobiet HPA1a ujemnych

Badania przeglądowe HPA1a można wykonać metodami biologii molekularnej. Przy badaniach masowych, dzięki automatyzacji, można zredukować koszt do kilkudziesięciu złotych. DNA izoluje się z niewielkiej próbki krwi pobranej na EDTA – tak jak na morfologię, przy czym nie może to być próbka, z której uprzednio wykonano inne badania (bo nie może być zanieczyszczona materiałem od innej osoby przeniesionym np. przez igłę automatu do badań morfologii). Próbki na badania molekularne mogą być zamrożone i przesyłane do badań w większych partiach, co obniża koszty transportu.

Konflikty w innych antygenach niż HPA1a

Około 5% przypadków AIMP/N jest spowodowane przeciwciałami przeciwko antygenowi HPA5b – dotyczy on kobiet o fenotypie HPA5aa. Rzadziej występuje AIMP/N spowodowana przeciwciałami przeciw antygenom HPA1b, HPA3a i HPA3b, HPA5a oraz HPA15a i b. Nasilenie małopłytkowości jest w tych konfliktach na ogół mniejsze niż w konflikcie z przeciwciałami anty-HPA1a, choć mogą wystąpić przypadki z głęboką małopłytkowością, a nawet krwawieniem do OUN. Bardzo rzadko występują przypadki AIMP/N spowodowane przeciwciałami przeciw antygenom HPA, które obecne są wyłącznie u ojca dziecka (tzw. antygeny prywatne) lub występujące z bardzo małą częstością w populacji. Wszystkie 27 antygenów HPA poznano dzięki temu, że spowodowały AIMP/N. W przypadkach wykrycia przeciwciał przeciw antygenom ojca, które nie reagują z płytkami dawców krwi o znanych antygenach, istnieje podejrzenie, że mamy do czynienia z przeciwciałami przeciw antygenom rzadko występującym lub jakiemuś nieznanemu antygenowi. W takich przypadkach istnieje wskazanie do prowadzenia dalszej diagnostyki, w której konieczne jest zastosowanie odpowiedniego zasobu metod molekularnych.

AIMP/N jest w Polsce, a także w innych krajach niedostatecznie często diagnozowana

Badania w kierunku AIMP/N w Polsce wykonywane są najprawdopodobniej wyłącznie w IHiT. W latach 2008-2011 skierowanych było na badania 108 kobiet (32 rocznie). Wykryto przeciwciała u 30/119 (28%). W 22 przypadkach były to przeciwciała przeciw 1a – 72%, 3b – 7%, 5b – 14%, 2b – 3%. Nie ustalono swoistości przeciwciał skierowanych przeciw płytkom ojca u 8 kobiet (7%).

Wykryto konflikt, czyli niezgodność antygenów, a nie wykryto (jeszcze?) przeciwciał u 26/108 (24%). Przeciwciała anty-HLA wykryto u 29 kobiet (27%). Porównanie tych danych z dotyczącymi liczby urodzeń wskazuje, że AIMP/N jest w Polsce niedostatecznie często diagnozowana. ^{18, 19, 20, 21, 22}

W 2009 roku było w Polsce 419 337 żywych (martwych 1748) urodzeń. Przyjmując częstość AIMP/N na poziomie 1/1000-1800 do diagnostyki powinno być kierowanych około 300 przypadków z wykrytym konfliktem, z czego 1/3 z głęboką małopłytkowością, a do diagnostyki kierowane jest, jak powiedziano wcześniej, ok. 30 kobiet rocznie. Wprowadzenie powszechnych badań w kierunku identyfikacji kobiet HPA1a ujemnych zwiększyłoby wykrywanie najczęstszego i najbardziej groźnego konfliktu powodującego AIMP/N

Diagnostykę AIMP/N prowadzi Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT: Pracownia Konfliktów Serologicznych, dr Małgorzata Uhrynowska, tel. 22 34 96600, wew. 221; Pracownia Immunologii Płytek i Leukocytów, prof. Krystyna Maślanka, tel. 22 3496 600, wew. 148, 206; Pracownia Genetyki Komórek Krwi i Chimeryzmu, dr Katarzyna Guz, tel. 22 3496 600, wew. 154.

{{{Ramka}}}