Znaczenie patofizjologiczne i kliniczne związanego z TNF czynnika indukującego apoptozę (TRAIL) i jego receptorów

powstawaniu oraz progresji nowotworów, prowadząc do nieprawidłowego zwiększania się żywotności komórek, wydłużania ich życia i utrwalania już zaistniałych mutacji. ^{2, 4} Apoptoza może być inicjowana dwiema drogami: wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową, które nierzadko ze sobą współwystępują. ^{2, 5}

Droga wewnątrzpochodna apoptozy, związana z mitochondriami i z aktywacją genów rodziny bcl-2, jest typową reakcją komórki na uszkodzenie DNA lub inne bodźce wewnątrzkomórkowe. ^{2, 4} W ten sposób przebiega zależna od genu p53 apoptoza komórkowa będąca skutkiem chemioterapii i radioterapii. ^{1, 2, 4, 6} Wiele nowotworów unika jednak apoptozy wewnątrzpochodnej na drodze mutacji i dezaktywacji genu p53. ⁴  

W mechanizmie zewnątrzpochodnym apoptoza jest indukowana w sposób niezależny od genu p53, poprzez przyłączenie się ligandu do tzw. receptorów śmierci. ^{4, 6} W zainicjowaniu tego procesu mają udział komórki immunokompetentne. Mogą one działać przez uwolnienie perforyn i granzymów lub na drodze interakcji z ligandami rodziny czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor – TNF): TNF-α, FasL (CD95L) i TRAIL, które są związane z „receptorami śmierci” na komórkach docelowych. ^{1, 2, 3, 4} W efekcie pobudzenia „receptorów śmierci” dochodzi do kaskady zdarzeń komórkowych prowadzących do zmniejszania się komórki, rozpadu jądra i powstania ciałek apoptotycznych, usuwanych następnie przez inne komórki na drodze fagocytozy. ^{2, 4, 6}

LIGAND TRAIL

Do rodziny TNF należy TRAIL – białko błonowe typu II, zbudowane z 281 aminokwasów, opisane po raz pierwszy w 1995 roku przez Wiley i wsp. ⁷ TRAIL jest kodowany przez gen zlokalizowany na chromosomie 3, składający się z pięciu egzonów i czterech intronów. ⁷ Wykazuje on sekwencje homologiczne z innymi białkami rodziny TNF, jak Fas (CD95) i RNF, odpowiednio w 28 proc. i 33 proc. ⁷ Ligand TRAIL występujący w postaci rozpuszczalnej ma masę 20 kDa, natomiast w formie związanej z powierzchnią komórek immunokompetentnych, takich jak komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty T i komórki NK, masę 33 kDa. ^{8, 9} Ligand TRAIL i jego receptory są obecne w wielu prawidłowych tkankach organizmu człowieka. ^{7, 8, 10}

W przeciwieństwie do innych ligandów, jak TNF-α czy FasL, których pobudzenie jest toksyczne dla prawidłowych komórek organizmu, TRAIL ma zdolność indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych, nie wykazując jednocześnie cytotoksyczności w stosunku do komórek prawidłowych, co potwierdzono w badaniach in vitro oraz in vivo. ^{3, 7, 8, 11, 12, 13} W wywołaniu apoptozy indukowanej przez TRAIL w komórkach nowotworów mogą pomagać czynniki chemiczne i fizyczne działające w mechanizmie wewnątrzpochodnym. ^{3, 14, 15, 16} Czynnikiem przeciwdziałającym apoptozie indukowanej przez TRAIL jest natomiast niedotlenienie, obecne często w centralnych fragmentach szybko rosnących nowotworów. ³ Obserwacja, że TRAIL selektywnie indukuje apoptozę jedynie w komórkach nowotworowych, nie powodując podobnego zjawiska w komórkach niezmienionych nowotworowo, stała się podstawą do licznych opracowań naukowych. ^{12, 13, 17, 18, 19, 20, 21}

RECEPTORY DLA LIGANDU TRAIL

Ligand TRAIL działa poprzez cztery receptory TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (DcR1/TRID/LIT) oraz TRAIL-R4 (DcR2/TRUNDD) znajdujące się na powierzchni komórek. Piątym receptorem jest rozpuszczalna osteoprotegryna (OPG), a połączenie z nią TRAIL nie wywołuje apoptozy. ^{9, 10, 11, 21, 22, 23, 24, 25} Wszystkie receptory komórkowe dla TRAIL mają sekwencje homologiczne w swojej domenie zewnątrzkomórkowej. Wewnątrzkomórkowe domeny receptorów DR4 i DR5 po połączeniu receptora z ligandem pełnią podstawową rolę dla zapoczątkowania apoptozy. ^{8, 21, 22, 23, 24, 25} Potwierdzono wysokie podobieństwo sekwencji receptorów DR4 i DR5 i różnice w termodynamice połączeń obu tych receptorów z ligandem TRAIL. ²⁵

Obecnie uważa się, że pobudzenie „receptorów śmierci” DR4 i DR5 powoduje ich oligomeryzację i indukuje apoptozę poprzez wewnątrzkomórkową domenę śmierci (death domain – DD). Wskutek połączenia DD z białkiem adaptorowym FADD (Fas-associated death domain) oraz z cytoplazmatyczną prokaspazą 8 powstaje kompleks DISC (death inducing signaling complex). ^{1, 2, 4, 8, 24} Połączenie DD z białkiem adaptorowym FADD może również aktywować prokaspazę 10, która prawdopodobnie wpływa na efekt proliferacyjny „receptorów śmierci”. ¹⁹ W niektórych komórkach już sama aktywacja kaspazy 8 jest wystarczająca do dalszego przebiegu apoptozy, w części komórek niezbędna jest również aktywacja drogi wewnątrzpochodnej. Aktywacja prokaspazy 8 prowadzi do aktywacji kaspazy 3, wiodąc w konsekwencji do wyzwolenia kaskady procesów wewnątrzkomórkowych prowadzących do oddzielenia się komórki od innych komórek, utraty wody i jej obkurczenia się. ^{1, 8, 9, 21, 26} Na różnych etapach dochodzi do aktywacji kaspazy 6 i 9 oraz innych substancji (ryc. 1). ^{2, 8, 9, 26}

Ryc. 1. Schematyczne przedstawienie apoptozy indukowanej przez TRAIL.

Ekspresję obu receptorów proapoptotycznych, tj. DR4 i DR5, wykazano w wielu lokalizacjach, w tym w leukocytach obwodowych, hepatocytach, neuronach, kanalikach krętych nerki, komórkach mięśnia sercowego, komórkach nabłonka jelitowego, nabłonku oskrzeli, komórkach przegród pęcherzyków płucnych, komórkach Leydiga, endometrium, a także w komórkach zarodkowych. ^{10, 27, 28, 29} Ekspresję DR4 bez obecności ekspresji DR5 potwierdzono w nabłonku dróg żółciowych, a obecność DR5 bez obecności DR4 zaobserwowano w nabłonku naczyń mózgowych, w komórkach pętli Henlego, w blaszce właściwej błony śluzowej jelit i w nabłonku naczyń oskrzelowych. ¹⁰

Przyłączenie się ligandu TRAIL do receptorów DcR1 i DcR2 nieposiadających domen cytoplazmatycznych, w przeciwieństwie do pobudzenia receptorów DR4 i DR5, nie prowadzi do apoptozy. ^{8, 11} Dochodzi jedynie do związania cząsteczek ligandu, pośrednio więc do zmniejszenia wysycenia ligandem receptorów DR4 i DR5 na drodze konkurencji i w efekcie do przeciwdziałania apoptozie. ²³ Jedna z koncepcji zakłada, że przyczyną, dla której ligand TRAIL nie powoduje apoptozy w prawidłowych komórkach organizmu, jest proporcjonalnie wysoka ekspresja na ich powierzchni „fałszywych” receptorów, tj. DcR1 i DcR2 („receptory ochronne”). ¹² Wyniki badań ostatnich lat pokazują jednak, że nie jest to jedyny mechanizm wyjaśniający zjawisko oporności prawidłowych komórek na apoptozę indukowaną przez TRAIL. ^{17, 21, 30, 31}

Obecność „receptorów ochronnych” DcR1 i DcR2 została potwierdzona w:

• hepatocytach,
• komórkach dróg żółciowych,
• nabłonku jelita grubego,
• neuronach,
• endometrium,
• komórkach mięśnia sercowego,
• komórkach zarodkowych,
• komórkach Leydiga. ^{10, 27, 32, 33}
  
  

Ekspresję DcR2 przy braku ekspresji DcR1 znaleziono w:

• kanalikach krętych nerki,
• komórkach nabłonka jelitowego,
• komórkach krypt jelitowych,
• nabłonku oskrzeli,
• przegrodach między pęcherzykami płucnymi,
• nabłonku naczyń krwionośnych płuc. ^{10, 27}
  
  

Ekspresję DcR1 bez obecności DcR2 stwierdzono natomiast w:

• nabłonku naczyniowym w mózgu,
• sercu. ¹⁰

LIGAND TRAIL JAKO POTENCJALNY ELEMENT W LECZENIU PRZECIWNOWOTWOROWYM

W ostatnich latach coraz częściej wskazuje się na rolę TRAIL jako cząsteczki efektorowej w zabijaniu komórek nowotworu złośliwego i jako potencjalnego narzędzia w leczeniu przeciwnowotworowym. ^{8, 34} Badania fazy przedklinicznej, a także badania kliniczne z zastosowaniem rekombinowanego ludzkiego ligandu TRAIL (recombinant human TRAWL – rhTRAIL) oraz agonistów receptora dla TRAIL w licznych nowotworach wykazały korzystny efekt przeciw­nowotworowy takiego postępowania. ^{5, 9} Potencjał terapeutyczny rozpuszczalnego rekombinowanego TRAIL potwierdzono m.in. w:

• płaskonabłonkowym raku głowy i szyi,
• raku piersi,
• raku płuc,
• raku jelita grubego,
• raku odbytnicy,
• raku trzustki,
• raku nerki,
• raku tarczycy,
• raku endometrium,
• raku gruczołu krokowego,
• glejakach,
• szpiczaku mnogim,
• białaczkach. ^{16, 20, 21, 34, 35}
  
  

W piśmiennictwie spotyka się jednak także doniesienia, które nie potwierdzają tej zależności, wskazując na oporność niektórych nowotworów na TRAIL, w tym części linii raka piersi, raka płuc (NSCLC), raka nerki, nowotworów układu krwiotwórczego (przewlekła białaczka limfocytarna) i guzów ośrodkowego układu nerwowego (niektóre glejaki, oponiaki, rdzeniak zarodkowy). ^{5, 30, 35, 36, 37}

Badania ostatnich lat pokazują, że stosując odpowiednie chemioterapeutyki, można „uwrażliwić” na TRAIL komórki nowotworowe pierwotnie na niego niewrażliwe. ^{9, 16, 18, 21, 36, 38, 39} Zjawisko takie zaobserwowano, m.in. stosując sorafemib w badaniach nad rakiem endometrium. ¹⁵ Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad rakiem jajnika i szyjki macicy oraz w nowotworach złośliwych w innych lokalizacjach. ^{12, 15, 40, 41}

Są także prowadzone badania w celu wykorzystania rekombinowanego ligandu TRAIL jako radiouczulacza u chorych poddawanych radioterapii w celu zwiększenia promienioczułości nowotworu. ¹⁴ W badaniach in vitro stwierdzono bowiem zwiększenie promienioczułości w pierwotnie niewrażliwych na radioterapię komórkach HeLa raka szyjki macicy oraz raka piersi, płuca, jelita grubego, a także nowotworu głowy i szyi, gdy pobudzono ich proapoptotyczne receptory dla TRAIL. ^{42, 43}

Możliwości i warunki do zastosowania ligandu TRAIL w praktyce klinicznej powinny być jednak rozpatrywane ostrożnie, ze względu na prawdopodobne niekorzystne działanie na ludzkie hepatocyty, szczególnie u pacjentów z zaburzeniami funkcji wątroby. ^{16, 44, 45}

ROZMIESZCZENIE I MOŻLIWE ZNACZENIE KLINICZNE RECEPTORÓW DLA TRAIL W NOWOTWORACH ZŁOŚLIWYCH

Większość opracowań dotyczących receptorów dla ligandu TRAIL w nowotworach dotyczy ich ekspresji cytoplazmatycznej. Opisano ją w wielu liniach komórkowych nowotworów in vitro, ale także w tkankach nowotworowych in vivo. Ekspresję cytoplazmatyczną DR4 i DR5 stwierdzono w:

• pierwotnych i przerzutowych guzach mózgu,
• białaczkach,
• czerniaku skóry,
• raku płuc,
• raku piersi,
• raku głowy i szyi,
• raku przełyku,
• raku jelita grubego,
• raku odbytnicy,
• raku trzustki,
• raku nerki,
• raku pęcherza moczowego,
• raku szyjki macicy,
• raku jajnika. ^{27, 46, 47, 48, 49, 50}
  
  

Wskazuje się na fakt, że występowanie błonowej ekspresji DR4 i DR 5 nie jest częste w przypadku ich wysokiej ekspresji cytoplazmatycznej. Taką właśnie zależność opisali Ganten i wsp. w raku piersi oraz Younes i wsp. w raku przełyku. ^{46, 48} W badaniu Gottwalda i wsp. błonową ekspresję DR4 i DR5 w gruczolakoraku endometrioidalnym endometrium obserwowano rzadko, odpowiednio u 12 proc. i 4 proc. chorych. ²⁹ Podobnie niskie odsetki przypadków wykazujących ekspresję błonową receptorów DR4 i DR5 opisano już wcześniej w rakach piersi i przełyku. ^{46, 48}

Ryc. 2. A – obecna ekspresja błonowa DR4 w prawidłowym endometrium (powiększenie 400 ×); B – obecna ekspresja błonowa DR4 w raku endometrium (powiększenie 400 ×); C – obecna ekspresja błonowa DR5 w prawidłowym endometrium (powiększenie 400 ×); D – brak ekspresji błonowej DR5 w raku endometrium (powiększenie 400 ×).

 Istnieje wiele doniesień dotyczących występowania „receptorów ochronnych” dla ligandu TRAIL w liniach komórkowych nowotworów in vitro. Ich wyniki nie są jednoznaczne. Analizując błonową ekspresję DcR1 i DcR2 w liniach Colo 205 and Caco-2 ludzkiego raka okrężnicy, Sträter i wsp. w większości przypadków nie zaobserwowali ekspresji żadnego z tych receptorów. ⁵¹ Tomek i wsp. w badaniu metodą RT-PCR, badając sześć linii komórkowych raka jajnika, uzyskali pozytywne wyniki dla wszystkich ocenianych linii komórkowych względem receptorów DcR1 i DcR2 i nie stwierdzili korelacji obecności ekspresji DcR1 i DcR2 z podatnością lub opornością na działanie ligandu TRAIL. ⁵² Z kolei Davidovich i wsp., prowadząc badania na linii komórkowej ludzkiego włókniakomięsaka HT1080/E14, zaobserwowali zarówno obecność komórek wykazujących ekspresję obu receptorów, jak i komórek niewykazujących tej ekspresji. Komórki oporne na działanie ligandu TRAIL cechowały się wyższym poziomem ekspresji DcR1 w porównaniu z komórkami podatnymi na działanie TRAIL. ⁵³

Ryc. 3. A – obecna ekspresja błonowa DcR1 w prawidłowym endometrium (powiększenie 400 ×); B – obecna ekspresja błonowa DcR1 w raku endometrium (powiększenie 400 ×); C – obecna ekspresja błonowa DcR2 w prawidłowym endometrium (powiększenie 400 ×); D – brak ekspresji błonowej DcR2 w raku endometrium (powiększenie 400 ×).

W badaniach prowadzonych na tkankach nowotworowych również oceniano ekspresję „receptorów ochronnych” dla ligandu TRAIL. Frank i wsp. ocenili ekspresję cytoplazmatyczną DcR1 i DcR2 w 19 pierwotnych i 11 przerzutowych guzach mózgu, stwierdzając obecność DcR1 odpowiednio w 18/19 i 9/11 przypadków, a DcR2 w 6/19 i 1/11 przypadków. ²⁷ W tkankach raka endometrium cytoplazmatyczna ekspresja DcR1, bez jednoczesnej oceny pozostałych receptorów dla TRAIL, została opisana przez Tarragonę i wsp. w 98 proc. z analizowanych 62 przypadków raka endometrium. ³² W badaniu Gottwalda i wsp. błonowa ekspresja DcR1 i DcR2 była obecna odpowiednio u 27,3 proc. i u 18,7 proc. chorych na raka endometrium. ³³ Połączenie wyników obu tych badań daje obraz rzeczywistego rozkładu „receptorów ochronnych” dla ligandu TRAIL w komórkach raka endometrium.

Z klinicznego punktu widzenia znajomość występowania i rozmieszczenia receptorów dla TRAIL w komórkach i tkankach nowotworów może okazać się istotna. Pojawiły się bowiem doniesienia o występowaniu korelacji wielkości ekspresji cytoplazmatycznej obydwu „receptorów śmierci” oraz „receptorów ochronnych” dla ligandu TRAIL ze zróżnicowaniem histologicznym i zawansowaniem nowotworów. ⁴⁶ Koksal i wsp. w raku gruczołu krokowego stwierdzili również dodatnią korelację ekspresji DcR2 z punktacją w skali Gleasona oraz ze stężeniem PSA. ⁵⁴ Nie wszyscy autorzy potwierdzają jednak występowanie podobnych zależności. Koornstra i wsp. nie zaobserwowali zależności pomiędzy ekspresją cytoplazmatyczną DR4 i DR5 a zróżnicowaniem histologicznym i zaawansowaniem raka okrężnicy. ²⁷ Z kolei u chorych z rakiem endometrium Tarragona i wsp. opisali brak różnic w obecności i wielkości ekspresji DcR1 w zależności od typu i zróżnicowania histologicznego oraz zaawansowania nowotworu. ³²

W piśmiennictwie pojawiają się również prace mówiące o możliwym znaczeniu prognostycznym ekspresji receptorów dla TRAIL w chorobie nowotworowej. Poglądy badaczy w tym zakresie różnią się jednak znacząco. Li i wsp. w dziesięcioletniej obserwacji opisali istotnie dłuższe przeżycie bez wznowy u chorych z rakiem pęcherza moczowego z wysoką ekspresją DR4 i DR5 w porównaniu z chorymi z niską ekspresją obydwu tych receptorów. ⁴⁷ W raku gruczołu krokowego Koksal i wsp. opisali zależność pomiędzy wysoką ekspresją DcR2 a wystąpieniem wznowy i długością przeżycia. ⁵⁴ Z drugiej jednak strony Zhuang i wsp. nie stwierdzili zależności cytoplazmatycznej ekspresji DcR1 i DcR2 z rokowaniem w chorobie nowotworowej. ⁵⁵

PODSUMOWANIE

1. Chociaż funkcje i znaczenie ligandu TRAIL, jego „rceptorów śmierci” i „receptorów ochronnych” oraz osteoprotegryny w prawidłowych i zmienionych nowotworowo komórkach są jest już dość dobrze zdefiniowane, to jednak wymagają dalszych badań.
2. Heterogenność receptorów sugeruje złożoność mechanizmów związanych z ich biologiczną funkcją, a wielkość ich ekspresji nie musi korelować z odpowiedzią na ligand TRAIL.
3. Należy mieć nadzieję, że dokonujący się na naszych oczach olbrzymi postęp pozwoli w niedługim czasie jednoznacznie określić możliwości zastosowania ligandu TRAIL i jego receptorów w praktyce klinicznej.