Insulina i jej podróż w czasie – także przyszłym

dla gatunku. Przez to obarczone były działaniami niepożądanymi, takimi jak reakcje alergiczne, tworzenie blokujących przeciwciał przeciwinsulinowych, ropnie w miejscu wstrzyknięcia i lipodystrofia. Występowały znaczące różnice w aktywności poszczególnych serii insuliny wytwarzanej przez pierwszego na świecie wytwórcę, firmę Eli Lilly, osiągające nawet do 25 proc. Przy okazji warto dodać, że w tamtych czasach igły przed wstrzyknięciem insuliny trzeba było samemu naostrzyć.

Z kolei wraz z ulepszonym oczyszczeniem insuliny zaobserwowano skracanie się czasu jej działania, co wiązało się z potrzebą zwiększania częstości podań leku. Skutkowało to albo brakiem przestrzegania zaleceń lekarskich i epizodami hiperglikemii, albo wręcz przeciwnie – nadmierną ekspozycją na szczycie stężenia we krwi wstrzykniętego hormonu i epizodami hipoglikemii.

Oczywista stała się konieczność udoskonalenia preparatów insuliny.

Cukrzyca Marii Krogh

W 1923 roku noblista, prof. August Krogh (1874-1949) z Uniwersytetu Kopenhaskiego, podróżujący po Kanadzie z cyklem wykładów, spotkał się z Frederickiem Bantingiem i Johnem Jamesem Rickardem Macleodem ze względu na osobiste zainteresowanie insuliną. Maria, żona Krogha, była chora na cukrzycę. Uzyskał wówczas zgodę University of Toronto na wytwarzanie insuliny w Skandynawii. W tym samym roku wraz z dr. Hansem Christianem Hagedornem (1988-1971) utworzyli fundację o charakterze non-profit o nazwie Nordisk Insulin Laboratorium i zaczęli wytwarzanie insuliny.

Co połączyło Krogha i Hagedorna? Była to cukrzyca pani Marii Krogh.

Hagedorn był lekarzem. W czasie studiów na Uniwersytecie Kopenhaskim zainteresował się pracą badawczą i uczył się jej od prof. Christiana Bohra, ojca noblisty Nielsa Bohra. Pracę lekarza rozpoczął w szpitalu w Hering, w zachodniej Danii, gdzie współpracował z miejscowym farmaceutą Birgerem Normanem Jensenem. W ramach tej współpracy wprowadzili innowacyjny sposób oznaczania stężenia glukozy we krwi. Metoda opracowana przez Hagedorna i Jensena została opisana i skorzystały z niej liczne laboratoria analityczne. Hagedorn przeniósł się w tym okresie życia do Kopenhagi, gdzie na tamtejszym uniwersytecie obronił doktorat o regulacji glikemii. Wtedy właśnie zainteresował się nim Krogh i poprosił Hagedorna, żeby został osobistym lekarzem jego żony. Kiedy Krogh uzyskał pozwolenie na wytwarzanie insuliny, Hagedorn stał się głównym motorem napędowym tego projektu w Danii.

Obojętna i protaminowa

Tymczasem marzono i prowadzono próby opracowania takiego preparatu insuliny, który miałby wydłużone działanie i byłby pozbawiony ostrego szczytu działania. Marzenie to spełnili jako pierwsi w 1936 roku Hagedorn ze współpracownikami Birgerem Normanem Jensenem i Ingerem Wodstrupem, opracowując insulinę protaminową. Protaminy to niskocząsteczkowe zasadowe białka występujące w spermie większości gatunków zwierząt, przez zespół Hagedorna wyizolowane z gonad ryb łososiowatych. Po zmieszaniu z insuliną protaminy zmniejszają jej rozpuszczalność, co powoduje spowalnianie początku działania i wydłużenie okresu działania.

Ta pierwotna insulina protaminowa musiała mieć obojętne pH i działała maksymalnie do 18-22 godzin, czyli wg dzisiejszych standardów była to insulina o pośrednim czasie działania. Nadano jej nazwę NPH od neutral (obojętna) protamin Hagedorn. Wkrótce potem na uniwersytecie w Toronto D.A. Scott i A.M. Fisher dokonali dalszego wydłużenia czasu działania insuliny do 36 godzin przez dodanie cynku do insuliny protaminowej. Tak powstała insulina protaminowo-cynkowa (PZI, protamine-zinc insulin).

W 1946 roku w firmie Nordisk otrzymano krystaliczną postać insuliny protaminowej, wprowadzono ją na rynek w roku 1950 i jest to ta postać insuliny NPH, która do dziś funkcjonuje w sprzedaży. Jej zaletą jest możliwość mieszania w dowolnej proporcji z insuliną szybko działającą i tworzenie preparatów dwufazowych.

Trylogia insulin lente

W 1951 roku opracowano nowe postaci insuliny o wydłużonym czasie trwania bez dodatku protaminy. Była to seria cynkowych insulin lente. Ich wytworzenie wynikało z obserwacji, że bezpostaciowe lub krystaliczne cząsteczki insuliny w obecności małych ilości soli cynku i przy nieobecności takich anionów jak fosforany lub cytryniany, są w pH obojętnym słabo rozpuszczalne. Tak więc można było sporządzić słabo rozpuszczalną zawiesinę insuliny w buforze octanowym, zapewniającym pH 7,1-7,5.

Wydłużenie działania hipoglikemizującego takiej zawiesiny wynika z jej małej rozpuszczalności. W zależności od stopnia nadmiaru cynku jako dodatku do insuliny podlegającej zawieszeniu w buforze octanowym, uzyskano farmakodynamiczne zróżnicowanie preparatów, które odpowiednio nazwano: semilente o pośrednim czasie działania oraz lente i ultralente, oba o długim czasie działania.

Insulinę w czystej krystalicznej postaci uzyskano w 1929 roku i było to jedno z pierwszych białek dostępnych w takiej formie do dalszych badań. W 1955 roku insulina była już związkiem o w pełni poznanej budowie i sekwencji aminokwasów: składa się z 21-aminokwasowego łańcucha A (od acidic, kwasowy) i 30-aminokwasowego łańcucha B (od basic, zasadowy) połączonych dwoma mostkami dwusiarczkowymi z udziałem siarki z aminokwasu cystyny. Łańcuch A ma jeszcze jeden wewnętrzny mostek dwusiarczkowy.

Zsekwencjonowanie insuliny przyniosło angielskiemu chemikowi Frederickowi Sangerowi Nagrodę Nobla w 1958 roku. Jako ciekawostkę można dodać, że była to jego pierwsza Nagroda Nobla. Jako jedyny naukowiec jak dotąd powtórzył ten sukces w dziedzinie chemii i w 1980 roku został ponownie nagrodzony za opracowanie enzymatycznej metody sekwencjonowania DNA.

Wysokooczyszczone preparaty

W 1974 roku udoskonalono preparaty insuliny, wprowadzając metodę oczyszczenia chromatograficznego ekstraktów trzustek zwierzęcych. Te wysokooczyszczone preparaty zawierały mniej niż 1 pmol/l białkowych zanieczyszczeń. Dzięki temu zredukowano do minimum tworzenie przeciwciał, alergie i lipoatrofię.

Firma Novo Nordisk nadała tym preparatom nazwę jednoskładnikowych (MC, monocomponent), a firma Eli Lilly nazwała je jednoszczytowymi (SP, single peak).

Ludzka syntetyczna

Naturalnym ciągiem dalszym tej historii była synteza insuliny ludzkiej. W latach 1953-1966 takiej syntezy dokonano jednocześnie w kilku miejscach na świecie. W Niemczech dokonał tego zespół Meienhofera, w Chinach Kunga, a w Stanach Zjednoczonych Panayotisa G. Katsoyannisa.

W roku 1975 w pełni syntetyczna insulina ludzka była wytwarzana przez Ciba-Geigy w Bazylei i rozpoczęto jej kliniczne testowanie. Okazało się, że działa szybciej niż insulina zwierzęca i jest lepiej tolerowana.

Ze względów ekonomicznych nigdy nie rozpoczęto produkcji syntetycznej insuliny ludzkiej na szeroką skalę i nie dokonano jej rejestracji.

Ludzka rekombinowana – Humulin

Wielki przełom w insulinoterapii nadszedł w 1978 roku. Wtedy to naukowcy z biotechnologicznej firmy Genentech z San Francisco w Kalifornii dokonali laboratoryjnej biosyntezy insuliny w procesie gwarantującym zaopatrzenie w ten hormon na skalę przemysłową.

Do syntezy insuliny użyto zmodyfikowanych genetycznie szczepów Escherichia coli, które wyposażone w ludzkie geny kodujące łańcuchy A i B, syntetyzowały ludzką insulinę w postaci dwóch oddzielnych łańcuchów. W drugim etapie dokonywano chemicznie ich połączenia.

W 1980 roku rekombinowana ludzka insulina przeszła w Anglii pierwsze testy z udziałem 17 zdrowych ochotników. Testy te potwierdziły jej skuteczność. Wyścig, którego metą była rejestracja produktu leczniczego zawierającego rekombinowaną insulinę ludzką, wygrała firma Eli Lilly. W 1982 roku amerykańska Food and Drug Administration dopuściła do obrotu ludzką rekombinowaną insulinę krótko działającą pod nazwą Humulin R i ludzką rekombinowaną insulinę o przedłużonym działaniu pod nazwą Humulin N.

Nieustający ciąg dalszy

Jak się szybko okazało, także ludzka insulina, jeśli jest stosowana jako lek, ma mankamenty. Głównym problemem w intensyfikacji leczenia okazało się występowanie hipoglikemii.

W celu przyspieszenia początku i szczytu działania oraz skrócenia działania rozpoczęto prace nad modyfikacją ludzkiej insuliny. W efekcie tych prac w firmie Eli Lilly w 1996 roku jako pierwsza powstała analogowa insulina lispro (Humalog) z zamianą kolejności proliny (B28) i lizyny (B29), co przyspieszyło wchłanianie leku z tkanki podskórnej. Kolejne bardzo podobne w profilu działania insuliny szybko działające zarejestrowano w 2000 roku – aspart (NovoRapid, Novo Nordisk) i w 2004 roku – glulizynę (Apidra, Sanofi-Aventis).

Efektem poszukiwania insulin o stabilnie długotrwałym działaniu z mniej wyraźnym szczytem efektu w porównaniu z długo działającymi preparatami insuliny ludzkiej było wprowadzenie na rynek długo działających analogów: w 2000 roku glarginy (Lantus, Sanofi-Aventis), w 2005 roku detemiru (Levemir, Novo Nordisk) i w 2013 roku degludeku (Tresiba, Novo Nordisk).

Obecnie trwają badania rozwojowe nad tzw. mądrymi preparatami insuliny (smart insulin). Preparaty te mają uwalniać insulinę proporcjonalnie do aktualnego stężenia glukozy w tkance podskórnej. Pierwszy preparat o prostej roboczej nazwie SmartInsulin (SmartCells) to polimer zawierający insulinę związaną odwracalnie z cząsteczkami wiążącymi glukozę. Insulina jest w tym przypadku uwalniana z polimeru tylko przy określonym stężeniu konkurującej o wiązanie glukozy. Drugi preparat, BIOD-Smart-Basal (Biodel), zawiera glarginę, oksydazę glukozy i peroksydazę. Przy odpowiednim stężeniu glukozy enzymy zawarte w preparacie przekształcają ją w kwas glukonowy, co powoduje obniżenie pH i poprzez zwiększenie rozpuszczalności glarginy nasila jej uwalnianie do krążenia.

∗∗∗

Tak więc od ponad 90 lat trwa nieustająco proces udoskonalania insulinoterapii, ale do tej pory nie osiągnęliśmy ideału, do którego nadal usilnie dążymy.