Genetyczne zróżnicowanie ostrych białaczek limfoblastycznych

DOTYCHCZASOWE SYSTEMY KLASYFIKACYJNE W OBL

Podstawowy podział OBL dokonywany jest na podstawie dominującego w obrazie rodzaju komórki, stąd OBL zostały następnie podzielone na:

• białaczkę B-prekursorową (B-OBL),
• T-prekursorową (T-OBL). ¹

Pierwotny podział B-OBL w ramach klasyfikacji FAB (ang. French-American-British) ma już tylko znaczenie historyczne. Podział EGIL dla T-OBL (ang. European Group for the Immunological Classification of Leukemias), opierający się na wyniku badania immunofenotypowego, określa fizjologiczny etap różnicowania limfocytu, któremu odpowiada dominujący liczbowo rodzaj komórek białaczkowych. Liczne badania potwierdzają jednak, że u podłoża poszczególnych podtypów białaczek, które zostały zdefiniowane na podstawie cytomorfologii oraz immunofenotypu, leżą swoiste zaburzenia genetyczne.

Ryc. 1. Wykresy przedstawiają częstotliwość występowania poszczególnych zmian cytogenetycznych i genetycznych w B-OBL (czarny tekst) i T-OBL (czerwony tekst) u dzieci i dorosłych. Wyjaśnienia skrótów w tekście.

W tej sytuacji kolejne systemy klasyfikacyjne, w tym aktualna wersja WHO 2008, ³ uwzględniają wybrane zmiany genetyczne jako podstawowe kryterium definiowania podjednostek choroby. Dzięki uwzględnieniu zaburzeń cytogenetycznych w kryteriach podziału, klasyfikacja WHO 2008 pozwala w sposób bardziej precyzyjny, niż czyniły to poprzednie wersje FAB i EGIL ustalić ryzyko nawrotu choroby.

Ponieważ klasyfikacja ta bierze pod uwagę jedynie duże zmiany chromosomalne, w założeniu nie jest doskonała, gdyż nie umożliwia subklasyfikacji dużej grupy pacjentów z kariotypem prawidłowym. Dalsza diagnostyka oraz różnicowanie ryzyka nawrotu choroby tej grupy stają się możliwe dzięki zastosowaniu bardziej zaawansowanych metod badań genetycznych, które poddają analizie cały genom: wysokorozdzielcze techniki, oparte głównie na technice mikromacierzy i łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Za pomocą tych metod, w grupie pacjentów bez dużych aberracji chromosomalnych – w ostatnich kilku latach wykryto obecność wielu zmian na poziomie pojedynczych nukleotydów (tzw. rearanżacje wewnątrzgenowe). ⁴ Dodatkowo okazuje się również, że zmiany te towarzyszą wielu dużym translokacjom chromosomalnym i ich obecność różnicuje rokowanie w danym cytogenetycznym podtypie OBL. Ostatnie badania wyjaśniają również mechanizmy niestabilności genetycznej w OBL, która prowadzi do rozwoju wtórnych aberracji genetycznych i przyczynia się do fatalnego przebiegu wielu podtypów białaczek.

Dzięki badaniom obejmującym analizę całego genomu, lista nowych aberracji genetycznych w OBL z roku na rok się wydłuża. Stworzenie zatem idealnej klasyfikacji, która uwzględniałaby wszystkie zaburzenia genetyczne i jednocześnie korelowała z klinicznym przebiegiem choroby, wydaje się być niezmiernie trudne. Niezbędne zatem jest całościowe podejście do zagadnienia transformacji OBL, uwzględniające pojawienie się tzw. aberracji pierwotnych, mających kluczowe znaczenie dla rozwoju patologii (ang. driver mutations), jak również dynamikę procesu nabywania mutacji wtórnych, w tym pojawianie się mutacji mniej istotnych dla procesu transformacji (ang. passenger mutations).

GENETYCZNA CHARAKTERYSTYKA B-OBL

Na podstawie klasyfikacji WHO w OBL wywodzącej się z linii B-komórkowej wyróżnia się podklasy cytogenetyczne związane z występowaniem dużych aberracji chromosomalnych: hiperdiploidii (> 50 chromosomów), hipodiploidii (< 50 chromosomów) oraz translokacji: t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1, t(12;21);(p13;q22); TEL-AML1, t(1;19); (q23;p13.3); E2A-PBX1, t(5;14)(q31;q32); IL3-IGH, a także rearanżacji genu MLL t(v;11q23). ³

B-OBL z genem fuzyjnym BCR-ABL1

W wyniku wymiany części ramion długich pomiędzy chromosomem 9 a chromosomem 22 powstaje tzw. chromosom Filadelfia, zawierający gen fuzyjny BCR-ABL1 kodujący białko o aktywności kinazy tyrozynowej. Nadekspresja tego białka jest charakterystyczna dla chorych z przewlekłą białaczką szpikową (PBSz), a także 25 proc. OBL u dorosłych i 2-5 proc. OBL u dzieci. ⁵

Klinicznie pacjenci z OBL BCR-ABL1-dodatni są starsi, mają większą liczbę blastów we krwi obwodowej i zaliczani są do grupy wysokiego ryzyka: otrzymują intensywniejszą chemioterapię oraz w miarę możliwości są kwalifikowani do procedur przeszczepienia komórek macierzystych krwi w pierwszej remisji. ⁶

Wyniki leczenia istotnie zmieniło wprowadzenie inhibitorów kinaz tyrozynowych (imatynib, dazatynib, nilotynib), dzięki którym rokowanie chorych bardzo się poprawiło. Okazuje się jednak, że grupa pacjentów BCR-ABL1-dodatnich nie jest jednorodna, jeśli chodzi o dynamikę postępu choroby. Badania Cazzaniga i wsp. na bliźniętach jednojajowych, które posiadały taką samą chorobę OBL BCR-ABL1-dodatnią wykazały, że pomimo wspólnej cechy, jaką jest obecność białka BCR-ABL1, kliniczny przebieg choroby może diametralnie różnić się w poszczególnych przypadkach. W badaniu tym jedno z dwójki bliźniąt w każdej z par zmarło wskutek szybkiego nawrotu choroby, mimo zastosowania transplantacji komórek macierzystych, podczas gdy drugie z bliźniąt nie przejawiało tak agresywnego przebiegu choroby. Czynnikiem różnicującym i wpływającym na ewolucję białaczki okazała się obecność mutacji punktowych/delecji genu IKZF1: stwierdzono bowiem, że bliźnięta, które zmarły z powodu nawrotu choroby, posiadały takie mutacje, podczas gdy te, które przeżyły – nie. ⁷

Gen IKZF1 koduje bardzo ważny czynnik transkrypcyjny – IKAROS, biorący udział w rozwoju limfocytów B. Delecje IKZF1 często pojawiają się u pacjentów B-OBL BCR-ABL1-dodatnich (ponad 80 proc.). ⁸ Ostatnie badania wykazują, że są one obecne także u 1/3 pacjentów pediatrycznych B-OBL-negatywnych pod kątem genu BCR-ABL, u których nie stwierdza się także obecności innych genów fuzyjnych (kariotyp prawidłowy). ⁹ W każdym z przypadków ich obecność związana jest z krótszym całkowitym przeżyciem oraz większym ryzykiem nawrotu choroby.

Podgrupa BCR-ABL1-like OBL

Badania den Boer i wsp. ⁹ wykazały, że profil ekspresji genów w wybranej podgrupie osób, u których nie stwierdzono obecności genu fuzyjnego BCR-ABL1, ale stwierdzono obecność mutacji w genie IKZF, wykazuje podobieństwo do profilu ekspresji genów u pacjentów BCR-ABL1-dodatnich. Podgrupa tych pacjentów została zatem nazwana BCR-ABL1-podobna (ang. BCR-ABL1-like) i tak jak w przypadku pacjentów BCR-ABL1-dodatnich, jest ona związana z gorszym rokowaniem.

Dalsze badania wykazały, że wraz z mutacjami w genie IKZF1 współwystępuje również nadekspresja genu CRLF2 (ang. cytokine-receptor-like factor), do której dochodzi w wyniku rearanżacji tego genu, oraz mutacje genów JAK1 i JAK2 (ang. Janus kinase 1 i 2). ^{10, 11} Zgodnie z ostatnimi doniesieniami, że w grupie tych pacjentów obserwuje się również mutacje aktywujące geny innych kinaz tyrozynowych, np. ABL1 lub receptorów dla cytokin takich jak: EPOR, IL7R, PDGFRB. ¹²

Białaczka BCR-ABL1-podobna stanowi ok. 20 proc. dziecięcych OBL, czyli u pacjentów pediatrycznych jest 10 razy częstsza niż BCR-ABL1-dodatnia OBL. ¹³

Ponieważ zaburzone mechanizmy molekularne w tych białaczkach prowadzą do aktywacji ścieżki JAK-STAT, może to stanowić w przyszłości ważny punkt uchwytu dla terapii celowanych. Dotychczas wykonane próby przedkliniczne wykazały, że komórki z rearanżacjami genów ABL1 i PDGFRB są wrażliwe na inhibitory kinaz tyrozynowych, takie jak imatynib czy dazatynib. Natomiast inhibitory kinaz JAK mogą być skuteczne w przypadku rearanżacji genów JAK2 i IL7R. ¹² Ciekawa jest obserwacja, że obydwa podtypy białaczek BCR-ABL1-dodatnich, jak również BCR-ABL1-podobnych, charakteryzują się szybszym tempem ewolucji klonalnej, co potwierdza obecność wtórnych mutacji towarzyszących. Wskazuje to na działanie czynników wpływających na niestabilność genetyczną komórek białaczkowych. ¹⁴

Ostatnie badania sekwencji punktów cięcia delecji w genie IKZF1 (ang. breakpoint regions) wykazały w ich pobliżu obecność sekwencji genomowych wskazujących na zaangażowanie genów kodujących białka aktywujące rekombinację tzw. RAG1/2 (ang. recombination activing gene1/2) ⁴ – enzymu wprowadzającego podwójne pęknięcia w DNA podczas rearanżacji łańcuchów immunoglobulin (Ig). Fakt ten sugeruje zaangażowanie fizjologicznych procesów w komórce limfocytu w progresję białaczki limfoblastycznej B-komórkowej. ¹⁵

B-OBL z rearanżacjami MLL

Gen MLL (ang. Mixed Lineage Leukemia) w stwierdzonych translokacjach chromosomowych może być partnerem dla ponad 80 różnych genów partnerskich. Białko to bierze udział w hematopoezie poprzez utrzymywanie prawidłowej ekspresji genów homeotycznych (HOX). ¹⁶ Rearanżacje z udziałem genu MLL są podłożem bardzo agresywnej postaci OBL CD10^– u noworodków i stanowi ona 80 proc. przypadków w tej grupie wiekowej. ¹⁷ Natomiast w grupie dorosłych z OBL ich odsetek jest znacznie niższy, często związany z wcześniej stosowaną chemioterapią inhibitorami topoizomerazy II. ^{16, 18}

Pięć najczęściej występujących translokacji z udziałem genu MLL (nazwa powstałego genu fuzyjnego jest podana po nazwie translokacji) to: t(4;11); MLL-AF4, t(9;11); MLL-AF9, t(11;19); MLL-ENL, t(10;11); MLL-AF10 oraz t(6;11); MLL-AF6. ¹⁹

Niektóre z nich mogą występować nie tylko w OBL, ale także w rozrostach mieloidalnych, np. w ostrej białaczce szpikowej (OBSz). Nieobecność bądź niewielka liczba dodatkowych mutacji świadczą o tym, że geny fuzyjne z udziałem genu MLL mają mocny potencjał transformujący komórki krwiotwórcze i nie wymagają wtórnych rearanżacji. Białaczki te wykazują również odrębny profil genetyczny i epigenetyczny. ²⁰

B-OBl Z genem fuzyjnym TEL-AML1

Translokacja t(12;21);(p13;q22) prowadząca do powstania genu TEL-AML1 jest najczęściej występującą zmianą genetyczną w dziecięcej OBL, osiągając szczyt występowania u chorych pomiędzy 1. i 10. r.ż. ^{21, 22} Gen fuzyjny TEL-AML1 z dużą częstotliwością jest wykrywany u noworodków, lata przed ujawnieniem się pełnoobjawowej OBL, co sugeruje z jednej strony, że do jego powstania dochodzi już w wieku prenatalnym, a także, że do pełnej transformacji nowotworowej wymagane są dodatkowe zmiany genetyczne. ²³

Badania potwierdziły, że genowi fuzyjnemu TEL-AML1 towarzyszą submikroskopowe aberracje, włączając w to delecje genów PAX5 i EBF1, jak również delecje drugiej kopii genu TEL. Okazało się, że mutacje wtórne, które występują znacznie częściej w TEL-AML1-pozytywnych OBL niż w innych podtypach białaczek, powstają w toku progresji choroby, jako wyraz niestabilności genetycznej i ewolucji klonalnej, która jej towarzyszy. Dlatego obecność genu TEL-AML1, chociaż wiąże się ze stosunkowo dobrym rokowaniem, może prowadzić do odległych nawrotów choroby u dzieci z jej remisją. ²⁴ Komórki powodujące te nawroty, oprócz obecności tego samego genu fuzyjnego TEL-AML1, często cechują się zmienionym fenotypem w porównaniu z wyjściowym klonem białaczkowym (nowe łącze VDJ w receptorach IgH/TCR, a także immunofenotypowe markery powierzchniowe). Analiza sekwencji genomowych punktów cięcia w obrębie aberracji wtórnych sugeruje, że do ich wystąpienia doszło, podobnie jak w przypadku mutacji towarzyszących BCR-ABL1 – w wyniku aktywności białek RAG1/2.

Wewnątrzchromosomowa amplifikacja chromosomu 21

Wewnątrzchromosomowa amplifikacja chromosomu 21 (iAMP21) jest rzadką zmianą na poziomie cytogenetycznym występującą u około 2 proc. dzieci z B-OBL i jest definiowana jako co najmniej trzykrotne zwielokrotnienie regionu chromosomu 21 zawierającego gen AML1. ²⁵ Amplifikacja iAMP21 pojawia się częściej u starszych dzieci i młodych dorosłych i jest związana ze złym rokowaniem. ²⁶

B-OBL z delecją genu ERG

Najnowsze badania wykazują, że mikrodelecje w genie ERG (ang. ETS-related gene) są związane z dobrym rokowaniem u dzieci i występują u chorych z kariotypem prawidłowym. Cechą charakterystyczną tej podgrupy B-OBL jest:

• podobna morfologia blastów w badaniu mikroskopowym,
• ekspresja markera CD2,
• częste inne submikroskopowe aberracje, jak delecje w genie IKZF1. ²⁷

Ostatnie badania wykazały, że pacjentów z B-OBL z mikrodelecją w genie ERG charakteryzuje unikatowy profil ekspresji genów. ²⁸

GENETYCZNA CHARAKTERYSTYKA T-OBL

Białaczki te stanowią mniejszość zarówno wśród OBL dzieci, jak i dorosłych. Jednocześnie fenotyp T-komórkowy OBL jest związany z gorszym rokowaniem niż B-komórkowy. W porównaniu również z innymi rozrostami wywodzącymi się z komórek krwiotwórczych, proces transformacji prowadzący do T-OBL wydaje się być bardziej złożony i wieloetapowy.

Aberracje genetyczne związane są przynajmniej z czterema różnymi procesami komórkowymi:

• różnicowania,
• regulacji cyklu komórkowego,
• proliferacji,
• zdolności do samoodnowy (ang. self-renewal capacity).

Aberracje te współwystępują równolegle w tej samej komórce, ich produkty współpracują ze sobą i prowadzą do fatalnego w skutkach efektu transformacji i progresji choroby.

W przeciwieństwie do B-OBL, w T-OBL dużo częściej obserwujemy rearanżacje związane z locus kodującym swoisty receptor tych limfocytów, tj. T – TCR (ponad 30 proc. T-OBL). Ich efektem może być nieprawidłowa ekspresja onkogenów biorących udział w dojrzewaniu limfocytu T: TLX1 (HOX11), TLX3 (HOX11L2), LYL1, TAL1. ²⁹ Fakt, że genem partnerskim w stosunku do wymienionych onkogenów jest TCR świadczy o tym, że geneza tych aberracji genetycznych związana jest ściśle z etapem dojrzewania limfocytów T, w którym dochodzi do rearanżacji receptorów TCR (β-selekcja).

Obok tych rearanżacji, w T-OBL występują także geny fuzyjne niezwiązane z receptorem TCR (np. SIL-TAL, CALM-AF10, NUP214-ABL) oraz mutacje pojedynczych nukleotydów.

Wieloetapowość procesu transformacji T-OBL podkreśla m.in. fakt częstego współistnienia mutacji np. w genie NOTCH1 lub delecji p16/INK4A oraz p14/ARF z innymi rearanżacjami genetycznymi u ok. odpowiednio 50 i 70 proc. chorych T-OBL – bez wyraźnej preferencji, jeśli chodzi o rodzaj towarzyszącej aberracji.

Wyniki badań wskazują, że podgrupy białaczek T-OBL według typu aberracji genetycznej nie są tak mocno związane z rokowaniem, jak w przypadku B-OBL. Związek z rokowaniem natomiast wykazują podgrupy T-OBL utworzone w ramach klasyfikacji, która uwzględnia fizjologiczne etapy dojrzewania limfocytu T ^{30, 31, 32} : EGIL oraz podział wg Asnafi i wsp. ³³ Szczególnie ten ostatni w oparciu o wynik badania klonalności immunofenotypu TCR dzieli T-OBL na formę: niedojrzałą, pre-α/β, oraz dojrzałą α-β i γ-δ. Pośród wymienionych białaczek, OBL pre-α/β odpowiada etapowi fizjologicznej β-selekcji i przejawia dobre rokowanie.

T-OBL z genem fuzyjnym SIL-TAL1

Translokacja SIL-TAL1 jest jedną z najczęstszych translokacji w T-OBL, szczególnie u dzieci. Jej efektem jest nadekspresja genu TAL1. ³⁴ Białaczki te cechują się odrębną charakterystyką:

• dużą liczbą białych krwinek (WBC),
• stężeniem hemoglobiny (Hb),
• ekspresją markerów CD2.

Rola tej translokacji w aspekcie rokowniczym zostaje nadal niejasna. ^{35, 36, 37}

T-OBL z genem fuzyjnym CALM-AF10

Translokacja t(10;11) występuje dość rzadko w T-OBL. Prace Asnafi i wsp. ³⁸ wskazują, że gen fuzyjny CALM-AF10 występuje w dwóch izoformach: izoforma CALM-AF10, związana z niedojrzałym fenotypem limfocytów T, cechuje się niekorzystnym rokowaniem, natomiast T-OBL CALM-AF10-dodatnia, wykazująca fenotyp TCR γ/δ, ulegała stosunkowo szybkiej całkowitej remisji. ³⁸

T-OBL z genem fuzyjnym NUP214-ABL

NUP214-ABL1 jest obserwowany u ok. 6 proc. pacjentów z T-OBL, i co ciekawe, ostatnio został również odnotowany w podgrupie B-OBL BCR-ABL-like. ¹² Podobnie jak w przypadku genu fuzyjnego BCR-ABL1, gen NUP214-ABL1 jest odpowiedzialny za konstytutywną aktywację kinazy tyrozynowej ABL1, co sprawia, że jest wrażliwy na inhibitory kinaz tyrozynowych. ³⁹

Mutacje aktywujące gen NOTCH1

Konsekwencją mutacji aktywujących NOTCH1 w T-OBL jest nadmierna ekspresja tego białka. ⁴⁰ Ponadto u ok. 15 proc. pacjentów występują dodatkowe mutacje genu FBXW7, które wzmagają aktywność białka NOTCH1. ⁴¹ Obecność tych mutacji stała się punktem wyjścia do prac nad terapią celowaną. ⁴² Badania kliniczne wykazały lepsze ogólne przeżycie chorych z mutacją NOTCH1 (OS – ang. overall survival). ⁴³

T-OBL z wczesnych komórek prekursorowych limfocytów T (ETP-OBL)

Niedawno została opisana grupa pacjentów T-OBL o bardzo niekorzystnym rokowniczo profilu genetycznym. ⁴⁴

ETP-OBL cechuje się również dużą liczbą zmian genetycznych, w tym tych charakterystycznych dla linii mieloidalnej, a więc przypominających ostrą białaczkę szpikową. Blasty ETP-OBL nie mają aberracji genetycznych powszechnie występujących w T-OBL, w tym także mutacji NOTCH1, czy delecji genu CDKN2A/B. ^{45, 46, 47}

PODSUMOWANIE – ROLA BADAŃ MOLEKULARNYCH W DIAGNOSTYCE OBL

• Ostatnie lata okazały się bardzo owocne w zrozumieniu genetycznego podłoża patogenezy OBL. Nowe techniki molekularne umożliwiające pełną analizę całego genomu komórki pozwoliły na wykrycie zmian submikroskopowych w obrębie genów ważnych dla wzrostu i różnicowania limfocytów. Badania wykazały, że niektóre z nich mogą stanowić niezależny czynnik prognostyczny, a w przyszłości narzędzie do kwalifikacji pacjentów dla terapii celowanych.
• W świetle obecnych badań wydaje się, że zarówno klasyczne badania stosowane do tej pory w rutynowej praktyce laboratoryjnej (cytogenetyka oraz immunofenotypowanie), jak również genetyka molekularna, mają odrębne, ale komplementarne znaczenie w diagnostyce oraz ustalaniu rokowania OBL: w B-OBL stratyfikacja ryzyka dokonuje się razem z oceną wyniku badania cytogenetycznego, natomiast w T-OBL równolegle z badaniem immunofenotypu. Niezależnie w obu przypadkach genetyka molekularna umożliwia śledzenie choroby resztkowej dzięki zastosowaniu allelospecyficznych primerów dla indywidualnego łącza VDJ genów – TCR i Ig, jak również obecności genów fuzyjnych. Dalsze poszerzenie listy markerów różnicujących rokowanie w tych grupach OBL, które wiąże się z zastosowaniem innowacyjnych technik – może okazać się pomocne w praktyce klinicznej.