Biomarkery w nowotworach neuroendokrynnych układu pokarmowego

kliniczne. Naturalny przebieg i rokowanie różni się znacznie między poszczególnymi rodzajami nowotworów neuroendokrynnych, dlatego szukamy precyzyjnych prognostycznych i predykcyjnych biomarkerów oraz markerów określających skuteczność terapeutyczną w tych nowotworach. Diagnostyka biochemiczna w nowotworach neuroendokrynnych obejmuje ocenę stężenia biomarkerów swoistych i nieswoistych w surowicy krwi lub w dobowej zbiórce moczu. Do tej pory za najbardziej użyteczny ogólny biomarker została uznana chromogranina A (CgA) w osoczu, pomimo istniejących znacznych różnic czułości w technikach jej pomiaru. Jest ona podstawowym, przesiewowym biomarkerem u chorych z podejrzeniem NEN, jednak niepotwierdzającym rozpoznania. Znaczną uwagę poświęca się badaniom nad nowymi biomarkerami, które być może uda się wykorzystać z większą skutecznością kliniczną niż chromograninę A.

Poza tym, w zależności od występujących u chorego objawów klinicznych, ocenia się stężenie biomarkerów swoistych dla danego zespołu klinicznego (insulina, gastryna, serotonina itp.). Jeśli NEN jest składową zespołu mnogiej gruczolakowatości wewnątrzwydzielniczej typu 1 (MEN1, multiple endocrine neoplasia type 1), wówczas diagnostykę biochemiczną należy poszerzyć o ocenę stężenia wapnia, parathormonu (PTH, parathyroid hormone) oraz hormonów przysadki mózgowej.

W diagnostyce biochemicznej nowotworów neuroendokrynnych wykorzystywane są biomarkery swoiste i nieswoiste:

1. Biomarkery swoiste

Pomiar stężenia swoistych biomarkerów NEN zależy od występującego zespołu objawów klinicznych, sugerujących określony rodzaj NEN hormonalnie czynnego (tab. 1), pomaga ustalić rozpoznanie i monitorować leczenie NEN czynnych hormonalnie. ¹

Serotonina jest produkowana i wydzielana przez NEN wywodzące się ze środkowego prajelita (midgut), głównie z jelita cienkiego, proksymalnej części jelita grubego, wyrostka robaczkowego, żołądka i płuc. Dwukrotne oznaczanie jej metabolitu – kwasu 5-hydroksyindolooctowego (5-HIAA, 5-hydroxyindoleacetic acid) w dobowej zbiórce moczu (DZM) stanowi badanie podstawowe w rozpoznaniu zespołu rakowiaka. Przy jego oznaczaniu należy zachować odpowiednią dietę oraz zakwasić dobową zbiórkę moczu, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich czy ujemnych.

Wśród przyczyn wyników fałszywie dodatnich 5-HIAA należy uznać:

a) produkty spożywcze – awokado, ananasy, banany, bakłażany, kiwi, orzechy włoskie, ser żółty,

b) leki – efedryna, fenobarbital, niektóre cytostatyki (cisplatyna, 5-fluorouracyl), paracetamol.

Do przyczyn fałszywie ujemnych wyników 5-HIAA zaliczamy:

a) produkty spożywcze – alkohol etylowy,

b) leki – heparyna, inhibitory MAO, hydrazyd kwasu izonikotynowego, kwas acetylosalicylowy, metylodopa, neuroleptyki i trójcykliczne leki przeciwdepresyjne,

c) niewydolność nerek,

d) nieprawidłowości techniki oznaczania (nieprawidłowo zebrana DZM i nieprawidłowe zakwaszenie moczu).

Niektóre NEN, prócz swoistych hormonów dla danego zespołu klinicznego, mogą produkować dodatkowe peptydy, co może pogarszać rokowanie tych NEN. ^{4, 5} Często takim biomarkerem jest CgA, której wyjściowe prawidłowe stężenie ulega podwyższeniu dopiero gdy pojawiają się przerzuty, co wiąże się z pogorszeniem rokowania. ³

Diagnostyka biochemiczna rzadkich hormonalnie czynnych NEN obejmuje ocenę stężenia swoistych biomarkerów, np. glukagonu czy enteroglukagonu, w surowicy krwi przy podejrzeniu glukagonomy (wynik pozytywny > 1000 pg/ml), wazoaktywnego peptydu jelitowego (VIP) (wynik pozytywny > 170 pg/ml), somatostatyny (wynik pozytywny w lokalizacji trzustkowej guza przekracza ponad 50-krotnie wartości referencyjne, wg niektórych autorów nawet 100-krotnie (tab. 1).

Tabela 1. Wybrane swoiste biomarkery w diagnostyce NEN, zmodyfikowano wg [2,3]

Ocena swoistych markerów NEN jest użyteczna w diagnozowaniu i monitorowaniu poszczególnych guzów, co przedstawia tabela 1. ⁶ Wskazania do ich oznaczeń są uzależnione od obrazu klinicznego chorego z NEN.

Wśród biomarkerów w NEN jelita cienkiego należy pamiętać o oznaczeniu stężenia CgA i serotoniny w surowicy krwi, wydalania kwasu 5-hydroksyindolooctowego (5-HIAA) w dobowej zbiórce moczu ^{7, 8} oraz niekiedy również oceny stężenia NT-proBNP (N-końcowy propeptyd natriuretyczny typu B)/rakowiakowa choroba serca. ⁹

Brakuje nadal swoistego biomarkera dla NEN jelita grubego. Do najczęściej ocenianych należy stężenie CgA w surowicy krwi, stężenie polipeptydu trzustkowego lub enteroglukagonu (w przypadkach guzów rozwijających się z odbytnicy), czasami może być podwyższone stężenie ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.

2. Biomarkery nieswoiste:

a) chromogranina A (CgA, chromogranin A) – jest powszechnie oznaczanym biomarkerem NEN. Jest ona kwaśnym, stosunkowo stabilnym białkiem, produkowanym i magazynowanym w ziarnistościach komórek rozproszonego układu endokrynnego (DES, diffuse endocrine system). Stężenie CgA jest podwyższone u 60-80 proc. chorych na nowotwory neuroendokrynne. Może być oznaczane w surowicy lub osoczu przy użyciu metod izotopowych (radioimmunologicznych, RIA) lub enzymatycznych (ELISA). ¹⁰ Istnieją jednak znaczne różnice pomiędzy technikami laboratoryjnymi oceny stężenia CgA, dlatego do tych pomiarów, zwłaszcza seryjnych, powinno się użyć tej samej techniki. ² Podwyższone stężenie CgA przybliża nas do postawienia rozpoznania NEN, jednak jej prawidłowe stężenie nie wyklucza tej choroby. Odmienności w stężeniu CgA mogą wynikać także z innych czynników, takich jak lokalizacja ogniska pierwotnego, stopień zaawansowania klinicznego nowotworu (staging) oraz stopień histologicznej złośliwości NEN (grading). ¹¹ Czułość badania stężenia CgA wynosi 67,9 proc. (10-100 proc.), a swoistość 85,7 proc. (68-100) ¹² (największą czułość opisano w guzach typu gastrinoma, glucagonoma i NEN jelita cienkiego, szczególnie przebiegającym z zespołem rakowiaka, z przerzutami do wątroby). Stężenia CgA przekraczające wartości referencyjne mogą wynikać z innych przyczyn, dając wyniki fałszywie dodatnie i ujemne, co przedstawia tabela 2. Yao i wsp. wykazali, że CgA jest niezależnym czynnikiem prognostycznym u chorych z NEN jelita cienkiego i trzustki. ¹³

Tabela 2. Przyczyny fałszywie dodatniego i ujemnego podwyższonego stężenia CgA, zmodyfikowano wg[17]

CgA może wskazywać na charakter neuroendokrynny nowotworu, może służyć do monitorowania przebiegu choroby, ale nie można jej użyć jako biomarkera do rozpoznania danego zespołu hormonalnie czynnego NEN.

U chorych z NEN trzustki podczas chemioterapii i leczenia ewerolimusem obniżenie stężenia CgA na początku terapii wiązało się z poprawą rokowania. ^{14, 15} Brak jest nadal prospektywnych badań oceniających użyteczność seryjnego oznaczania stężenia CgA do monitorowania odpowiedzi na leczenie, dlatego Narodowy Instytut Raka (National Cancer Institute, NCI) zaleca włączenie seryjnych oznaczeń stężenia CgA do przyszłych badań klinicznych; ¹⁶

b) chromogranina B (CgB, chromogranin B) – jest drugą graniną, która została poddana badaniom, ale jest słabiej poznana niż CgA. Jej stężenie może być zwiększone w guzie typu insulinoma, NEN odbytnicy i NEN jajników. Stężenie CgB w surowicy jest znacznie mniejsze niż stężenie CgA u większości chorych z NEN, jednak w niektórych przypadkach NEN, gdzie stężenie CgA było prawidłowe, stwierdzono zwiększone stężenie CgB (chorzy z MEN1 oraz NEN dwunastnicy lub odbytnicy) – w tych grupach pomiar stężenia CgB może być użyteczny; ¹⁸

c) neuronospecyficzna enolaza (NSE, neuron-specific enolase) – charakteryzuje się mniejszą czułością i specyficznością w porównaniu z CgA, jest również biomarkerem prognostycznym i pomocnym w monitorowaniu leczenia NEN, głównie trzustki, ¹³ jej zwiększone stężenie zarejestrowano w nisko zróżnicowanych rakach neuroendokrynnych (NEC). Zwiększenie czułości rozpoznania NEC powoduje równoczesne oznaczenie NSE i CgA;

d) polipeptyd trzustkowy (PP, pancreatic polypeptide) – może być użytecznym markerem nieczynnych hormonalnie NEN trzustki, głównie gdy są składową zespołu MEN1 (czułość 50-80 proc. w NEN trzustki i > 30 proc. we wszystkich typach NEN). ¹⁹ Do czynników, które mogą nieswoiście zwiększać stężenie PP, należą: biegunka, leki przeczyszczające, stany zapalne jelit, przewlekłe choroby nerek, spożycie posiłku, wysiłek fizyczny i podeszły wiek; ²⁰

e) ludzka gonadotropina kosmówkowa (HCG, Human Chorionic Gonadotropin), głównie podjednostka beta, jest biomarkerem często oznaczanym u chorych z NEN, z uwagi na łatwą dostępność;

f) pankreostatyna – nowy biomarker NEN – stanowi fragment CgA (głównie wykorzystywana u chorych z NEN stosujących IPP, ponieważ leki te nie zwiększają jej stężenia). ^{2, 20}

Ocenę stężenia większości tych biomarkerów należy wykonać rano na czczo, ponieważ posiłek może znacznie je fałszywie zawyżać. ^{3, 21}

Do najczęstszych hormonalnie czynnych NEN należą guzy typu insulinoma i gastrinoma. Poniżej przedstawiono biochemiczne kryteria ich rozpoznania:

Insulinoma

Nadal złotym standardem w rozpoznaniu insulinoma jest 72-godzinna próba głodowa, którą należy przeprowadzić w warunkach szpitalnych. U chorych z insulinoma seryjny pomiar glikemii wykazuje jej niskie wartości już w ciągu pierwszych 24 godzin tej próby, u 5 proc. chorych hipoglikemie występują po posiłkach. ²² Podczas hipoglikemii (stężenie glukozy we krwi ≤ 40 mg/dl lub ≤ 2,2 mmol/l) jednocześnie oceniamy stężenie insuliny, peptydu C i (niekiedy) proinsuliny (tab. 3).

Tabela 3. Kryteria rozpoznania guza typu insulinoma

Potwierdzeniem autonomicznie wydzielającego guza typu insulinoma jest brak adekwatnego hamowania wydzielania insuliny w obecności hipoglikemii. ^{3, 21}

Gastrinoma

Diagnostykę biochemiczną w kierunku gastrinoma rozpoczynamy od oznaczenia na czczo stężenia gastryny w surowicy krwi, które jest podwyższone u blisko 98 proc. chorych (niemal u wszystkich chorych wartości > 150 pg/ml, a przy stężeniu > 1000 pg/ml i jednoczesnej hipersekrecji HCl rozpoznanie gastrinoma bardzo prawdopodobne).

Hipergastrynemia w surowicy nie jest kryterium ostatecznym rozpoznania gastrinoma, ponieważ może ona być spowodowana chorobami przebiegającymi z hipochlorhydrią/achlorhydrią (przewlekłe autoimmunologiczne zanikowe zapalenia błony śluzowej żołądka) czy hiperchlorhydrią (infekcja Helicobacter pylori, niewydolność nerek, zespół krótkiego jelita).

Jeśli stężenie gastryny na czczo jest ponad 10-krotnie podwyższone i pH żołądka wynosi < 2, można rozpoznać gastrinoma. U 60 proc. pacjentów stężenie gastryny nie jest bardzo podwyższone (< 10 razy) i znajduje się w zakresie obserwowanym przy innych rozpoznaniach, m.in. podczas leczenia inhibitorami pompy protonowej (IPP) u pacjentów bez gastrinoma. IPP i antagoniści receptora H₂ podnoszą stężenia gastryny we krwi, dlatego IPP powinny zostać odstawione na 10-14 dni przed planowanym oznaczeniem jej stężenia. U chorych z podejrzeniem gastrinoma zamiast IPP w tym okresie można podać doustne preparaty antagonistów H₂, ale wskazane jest, by zostały one również odstawione na 48 godzin przed badaniem. ²³ Należy poinformować tych chorych, że że zaprzestanie stosowania IPP bez nadzoru jest niebezpieczne.

W przypadku dalszych wątpliwości dotyczących rozpoznania gastrinoma, jeśli stężenie gastryny na czczo jest podwyższone mniej niż 10 razy, a pH soku żołądkowego ≤ 2, należy przeprowadzić test sekretynowy, z oceną kwasu żołądkowego lub bez niej. Przy oznaczaniu stężenia gastryny w kolejnych dniach, tylko u mniej niż 0,5 proc. chorych z gastrinoma stwierdza się wartości mieszczące się w granicach wartości referencyjnych. Z kolei pH soku żołądkowego powyżej 3 prawdopodobnie wyklucza gastrinoma.

Ektopowa produkcja biomarkerów (hormonów)

Źródłem wydzielania biomarkerów mogą być również ektopowo wydzielające NEN układu pokarmowego (głównie trzustki). W zależności od produkowanego i wydzielanego biomarkera, mogą wywoływać różne zespoły kliniczne,np. GH lub GHRH w akromegalii, ACTH w zespole Cushinga, wazopresynę w zespole nieadekwatnego wydzielania wazopresyny (SIADH), PTH-RP w zespole hiperkalcemii. ²⁴

Dyskusja

Biomarkery mogą wykrywać chorobę wcześnie, służyć do stratyfikacji ryzyka pacjentów i monitorowania odpowiedzi na leczenie. CgA, białko wydzielane przez komórki neuroendokrynne, ma ograniczenia biologiczne w przewidywaniu proliferacji komórek i skuteczności terapeutycznej. Jest powszechnie stosowanym biomarkerem nieswoistym, jako pojedynczy marker ma ograniczoną wartość i wymaga dalszych badań klinicznych oceniających jej seryjne pomiary do oceny skuteczności terapeutycznej w tej grupie chorych.

Rozwój biologicznej terapii celowanej u chorych z NEN wymusza identyfikację nowych biomarkerów, które pozwolą lekarzowi wyselekcjonować grupę pacjentów najlepiej odpowiadających na określone czynniki molekularne, a tym samym określić skuteczność terapeutyczną. Podczas corocznego sympozjum ASCO 2013 (American Society of Clinical Oncology) również wielu autorów w swoich pracach poruszało ten temat. Chou i wsp. pokazali, że niskie stężenie CgA wiąże się ze znacznie lepszą przeżywalnością i korzystną odpowiedzią na leczenie oraz że podstawowe i seryjne oznaczenie stężenia CgA może być używane do monitorowania wyników klinicznych. ²⁵

Modlin i wsp. wykazali, że tzw. wielo-transkrypcyjny molekularny podpis (multi-transcript molecular signature) w analizie PCR był znacznie czulszą metodą w diagnostyce w diagnostyce nowotworów neuroendokrynnych żołądkowo-jelitowo-trzustkowych (GEP-NENs) i wykrywaniu różnic w odpowiedzi na leczenie w porównaniu z oceną stężenia CgA. ²⁶

Grande i wsp. w swojej pracy zauważyli, że u pacjentów leczonych pazopanibem stężenia krążącego receptora typu 2 dla śródbłonkowego czynnika wzrostu naczyń (sVEGFR2) były obniżone po tym leczeniu i większy spadek ich stężenia był związany z dłuższym czasem wolnym od progresji (PFS). ²⁷ VEGFR2 może stanowić potencjalny marker molekularny dla terapii inhibitorem ródbłonkowego czynnika wzrostu naczyń (VEGF) i inhibitorem wielu kinaz. ²⁸ Z kolei Casanovas i wsp. dowiedli, że mimo iż większość NEN ma ekspresję receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF1R), tylko mała część guzów wykazuje aktywację szlaku IGF1R –mTOR. ²⁹ Ekspresja p-mTOR i IGF1R może potencjalnie pomóc w stratyfikacji pacjentów w przyszłych badaniach klinicznych.

Według Heetfeld i wsp., w nisko zróżnicowanych rakach neuroendokrynnych (NEC) wysoka ekspresja fosforylowanej kinazy mTOR i jej efektora p-eIF4E wiązała się ze znacznie krótszym czasem przeżycia. ³⁰ Potrzebne są jednak dalsze badania, aby przeanalizować te markery i określić ich znaczenie kliniczne w analizowanej grupie NEN.

Omówione powyżej nowe biomarkery prezentuje tabela 4.

Podsumowanie

Podstawowym testem biochemicznym u chorego z podejrzeniem nowotworu neuroendokrynnego układu pokarmowego (GEP-NEN) powinno być oznaczenie stężenia chromograniny A w osoczu i kwasu 5-hydroxyindolooctowego w dobowej zbiórce moczu. ³²

CgA jest zalecanym markerem nowotworowym, podczas gdy czułość i swoistość polipeptydu trzustkowego (PP), stymulowanego posiłkiem, są kontrowersyjne.

PP może być przydatny do wczesnego wykrywania NEN trzustki w MEN1.

Specyficzne testy biochemiczne nie są wykonywane rutynowo, powinno się je wykonywać, jeśli u pacjenta pojawią się objawy sugerujące hormonalny zespół kliniczny.