Preparat bezpośredni – barwienie metodą Grama

Jest to prosta, tania i szybka metoda diagnostyczna o czułości 75-90%.^5,17,25 U chorych leczonych antybiotykami przed badaniem PMR czułość obniża się nawet do 9,1%,²⁶ choć w badaniu Bohra i wsp. czułość barwienia metodą Grama u 481 duńskich pacjentów z ZOMR po zastosowaniu antybiotyku spadła nieznacznie (z 56 do 52%).²⁰ Także badania w grupie amerykańskich dzieci wykazały nieznaczne obniżenie czułości metody.²¹

Czułość zależy od gatunku bakterii i wynosi 90% dla S. pneumoniae i S. aureus,^27,28 86% dla H. influenzae,²⁹ 75% dla N. meningitidis, 50% dla Gram ujemnych pałeczek oraz <50% dla L. monocytogenes i bakterii beztlenowych.³⁰ Swoistość tej metody w przypadku niektórych bakterii sięga 100%.^4,16,31

Testy lateksowe

Testy lateksowe (latex agglutination, LA) służą do wstępnej diagnostyki bakteryjnego ZOMR, bezpośredniego wykrywania jakościowego w PMR, surowicy lub moczu antygenów następujących bakterii: H. influenzae typu B, S. pneumoniae, N. meningitidis grupy B oraz Escherichia coli K1. Wynik jest dostępny w ciągu 15 minut.³² Choć cechują się zmienną czułością (78-100% dla H. influenzae typu B, 59-100% dla S. pneumoniae i 22-93% w przypadku meningokokowego ZOMR) powinny być stosowane w diagnostyce.^26,33,34

Dzięki LA można wykazać obecność antygenów bakteryjnych jeszcze po wyjałowieniu PMR, a antygeny H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae można wykazać we krwi i PMR do 10 dni od rozpoczęcia antybiotykoterapii. Thirumoorthi i Dajani stwierdzali antygeny H. influenzae typu B w moczu, surowicy i PMR do 3 dni od rozpoczęcia antybiotykoterapii.³⁵

Zaletą LA jest fakt, że pozwalają one na wykrycie antygenów pochodzących również z martwych komórek bakteryjnych. Metoda polega na reakcji rozpuszczalnych bakteryjnych antygenów polisacharydowych obecnych podczas zakażenia w płynach fizjologicznych (PMR, surowica, mocz) z cząsteczkami lateksu opłaszczonymi swoistymi przeciwciałami. Obecność w materiale swoistych antygenów powoduje powstawanie kompleksu antygen-przeciwciało widocznego w postaci aglutynacji.

Antygeny bakteryjne można wykrywać także w surowicy i moczu, ponieważ rozpuszczalne polisacharydy błony komórkowej bakterii przechodzą przez komórki śródbłonka kapilarów i są wydzielane do moczu. W związku z tym mocz może być alternatywnym do PMR materiałem diagnostycznym.³⁶ Surowica jest gorszym materiałem do badania, ponieważ antygeny polisacharydowe mogą łączyć się z przeciwciałami i innymi białkami surowicy, mogą być metabolizowane lub usuwane przez limfocyty.³⁷

Ograniczeniem LA są niespecyficzne reakcje krzyżowe, np. z czynnikiem reumatoidalnym, zhemolizowanymi erytrocytami czy białkiem obecnym w badanym materiale. Ponadto ograniczenia mogą wynikać z niskiego stężenia antygenów w badanym materiale. Użycie pepsyny, białka A i EDTA zmniejsza częstość reakcji niespecyficznych, ale wymaga podgrzewania próbek przez 5-15 minut. Podgrzewanie uwalnia antygeny bakteryjne już związane z białkami PMR. Niestety antygen N. meningitidis jest wrażliwy na ciepło i nie można go wykazać testami LA, jeśli próbka została podgrzana do 100˚C.^38,39 Opisano także krzyżowe reakcje między reagentem LA H. influenzae a S. pneumoniae, N. meningitidis typu C, S. aureus i E. coli.⁴⁰

Uzyskanie negatywnego wyniku testu w kierunku swoistego antygenu bakteryjnego nie wyklucza rozpoznania bakteryjnego ZOMR.

Metoda PCR

Testy amplifikacji kwasów nukleinowych, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), są także przydatne w diagnostyce bakteryjnego ZOMR.⁴¹ Tzanakaki i wsp. oceniali przydatność multipleksowego PCR do wykrywania bakterii N. meningitidis, S. pneumoniae i H. influenzae typu B, który cechował się całkowitą selektywnością. Zarówno dodatnia, jak i ujemna wartość predykcyjna wynosiły >99%.⁴² Czułość i swoistość metody PCR w diagnostyce ZOMR o etiologii S. pneumoniae waha się od 92 do 100%.⁴³

Zaletą metod opartych na PCR jest możliwość uzyskania wyników dodatnich nawet do 72 godzin od wdrożenia antybiotykoterapii, ponieważ wykrywany jest także materiał pochodzący z zabitych komórek bakterii. Metoda PCR sprawdza się także wtedy, gdy do badań pobrano bardzo małą ilość materiału klinicznego, z czym często mamy do czynienia u dzieci. Jeśli w pracowni nie jest możliwe szybkie wykonanie takiego badania, to materiał kliniczny należy po pobraniu zabezpieczyć i zbadać później na miejscu lub wysłać do ośrodka, który takie badania wykonuje. W Polsce jest to Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Diagnostyki Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN).⁴⁴

W KOROUN stosuje się metodę PCR do potwierdzania etiologii bakteryjnej ZOMR wywoływanych przez najczęstsze czynniki etiologiczne: N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, L. monocytogenes, S. agalactiae i E. coli. Dla szczepów otoczkowych H. influenzae, oprócz identyfikacji gatunku, istnieje również możliwość określania typów serologicznych, a w przypadku N. meningitidis najczęstszych grup serologicznych – A, B, C, Y i W-135. Dla pneumokoków możliwa jest identyfikacja gatunku i wybranych typów serologicznych. Materiałem klinicznym przydatnym w diagnostyce molekularnej są: pełna krew, surowica, PMR i materiał pobrany post mortem (krew z komór serca, wycinki śledziony, nerki, płuc, wątroby i fragmenty zmienionej krwotocznie skóry [wybroczyny]). Wymagana minimalna objętość PMR do badania PCR to 200 μl.⁴⁵

Istnieją także doniesienia o przydatności oznaczania genu rmpM Neisseria meningitidis bezpośrednio w PMR z zastosowaniem swoistych starterów. Amplikon o wielkości 308 bp genu rmpM nie wykazuje homologii z innymi organizmami i może być stosowany jako marker genetyczny bakteryjnego ZOMR o etiologii Neisseria meningitidis.⁴⁶

Badanie immunologiczne

W przypadku neuroboreliozy zastosowanie znajdują metody oceniające wewnątrzoponową syntezę przeciwciał przeciwko B. burgdorferi przy zastosowaniu testów Western blot do badania płynu mózgowo-rdzeniowego i testów typu immunoblot.⁴⁷

Typowanie serologiczne jest jedną z metod diagnostycznych, które w przypadku wielu gatunków bakteryjnych utraciło swoją dawną pozycję na rzecz nowszych, szybszych, bardziej powtarzalnych i rozdzielczych metod genetycznych. Krajowy Ośrodek Referencyjny w Warszawie typuje serologicznie szczepy N. meningitidis metodą ELISA.⁴⁴ Obecnie metodą aglutynacji szkiełkowej za pomocą specyficznych surowic określa się typy serologiczne H. influenzae (A-F). Serotypy S. pneumoniae określa się w reakcji pęcznienia otoczek. Ze względu na wymaganą dużą liczbę próbek (ponad 90 serotypów) typowanie to wykonuje się w niewielu ośrodkach na świecie.⁴⁴

Badanie pęcznienia otoczek (reakcja Quellunga)

Jest to metoda rzadko używana, przydatna jedynie dla szczepów posiadających otoczki (np. S. pneumoniae, N. meningitidis, otoczkowe H. influenzae). W badaniu tym kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni bakterii powoduje zmiany jej otoczki, co widać pod mikroskopem. Otoczka staje się przezroczysta i spęczniała. Metoda ta wymaga dużego stężenia przeciwciał i doświadczonego personelu. Może służyć do identyfikacji gatunku, ale przede wszystkim jest wciąż metodą referencyjną w serotypowaniu pneumokoków.⁴⁸