Dostęp Otwarty

Transplantologia

Metody oceny stopnia immunizacji biorców nerek

Iwona Dudzik

Konsultacja medyczna: prof. Alicja Dębska-Ślizień1

1Kierownik Katedry i Kliniki Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych GUMed, ordynator Kliniki Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych w UCK, pomorski konsultant wojewódzki w dziedzinie nefrologii

– Nowoczesne metody badania stopnia immunizacji pacjentów czekających na przeszczepienie nerek pozwalają na lepszy dobór pomiędzy dawcą i biorcą. Chcielibyśmy, aby te metody, które w ostatnich latach testowaliśmy, stały się rutyną przy kwalifikacji chorych – mówi prof. dr hab. med. Roman Danielewicz, dyrektor Poltransplantu, który wraz z ośrodkami przeszczepiania oraz pracowniami badań HLA podsumował działania projektu i przedstawił wnioski.

Określenie stopnia immunizacji biorcy przeciwko antygenom dawcy jest kluczowe, ponieważ to właśnie takie uczulenie często decyduje o tym, czy przeszczep nerki zostanie odrzucony. Jeśli biorca jest osobą wysoko immunizowaną, ryzyko odrzucenia jest znacznie podwyższone. Wykonanie przeszczepienia u takich osób wiąże się też z koniecznością zwiększonej immunosupresji i większym ryzykiem działań niepożądanych stosowanych leków. Mimo stosowania silniejszego leczenia immunosupresyjnego przeżywalność nerek u biorców immunizowanych antygenami dawcy często jest krótsza.

W celu oceny, czy biorca jest osobą immunizowaną (większe ryzyko odrzucania, konieczność stosowania silniejszej immunosupresji), oznacza się obecnie panel przeciwciał tzw. PRA (panel reactive antibody PRA), czyli stopień uczulenia tej osoby na antygeny występujące w danej populacji za pomocą testu limfocytotoksycznego (metoda serologiczna CDC). Liczbę reakcji dodatnich wyraża się procentowo – w skali od 0 do 100 proc. PRA CDC polega na ocenie obecności u biorcy przeciwciał przeciw limfocytom pochodzącym od 30 niespokrewnionych dawców krwi reprezentujących populację danego regionu (np. Polska). Im wyższa wartość, tym wyższy stopień immunizacji, czyli gotowości układu odpornościowego do reakcji przeciwko antygenom występującym w populacji, a tym samym do odrzucenia przeszczepu pochodzącego od osoby z tej populacji. Testy PRA w Polsce, jak wcześniej wspomniano, wykonuje się metodą serologiczną, czyli jedną ze starszych metod. Testy wykonywane są co kilka miesięcy i często uzyskane wyniki się różnią, np. PRA 30 proc., a kolejne 0 proc.

Prof. dr hab. med. Piotr Trzonkowski, kierownik Zakładu Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra Immunologii, GUMed

Nowe metody znacznie zwiększają szanse na identyfikację biorców zimmunizowanych. Ich zasadniczą przewagą jest wyższa czułość i możliwość dokładnego oznaczenia, przeciw jakim konkretnie antygenom HLA (i nie tylko) występują przeciwciała u potencjalnego biorcy. Kilka lat temu przeprowadziliśmy z Poltransplantem badania porównujące metodę fazy stałej z serologiczną. Badania te objęły całą populację oczekujących na przeszczep nerki (Moszkowska i wsp. Human Immunology 2014) i potwierdziliśmy w nich, że zastosowanie metod fazy stałej pozwala wyłowić nawet kilkanaście procent biorców, którzy w klasycznych metodach serologicznych (CDC) byli niezimmunizowani, a jednak znaleźliśmy u nich przeciwciała anty-HLA metodami fazy stałej.

W praktyce oznacza to, że jeśli zimmunizowany pacjent zidentyfikowany metodą serologiczną jako niezimmunizowany otrzyma niezgodny przeszczep, to istnieje bardzo duże ryzyko rozwinięcia reakcji odrzucenia. Nawet niskie miana przeciwciał anty-HLA – możliwe do wykrycia jedynie metodami fazy stałej – oznaczają, że istnieje pamięć immunologiczna i układ odpornościowy bardzo szybko zareaguje wzrostem ich miana po przeszczepie, co klinicznie będzie widoczne jako odrzucanie.

Z drugiej strony metody fazy stałej to szansa szczególnie dla pacjentów wysoko zimmunizowanych. Metody serologiczne informowały jedynie, że pacjent jest zimmunizowany, i określały, jakiego procentu populacji potencjalnych dawców dotyczy to zimmunizowanie (PRA w skali od 0 do 100 proc.), bez możliwości identyfikowania, przeciw jakim konkretnie HLA są te przeciwciała. Nowe metody dają taką możliwość – identyfikujemy przeciwciała przeciw konkretnym HLA, co pozwala na szybki i skuteczny dobór dawca-biorca w oparciu o typowanie tkankowe. W praktyce oznacza to, że czas oczekiwania na przeszczep w grupie pacjentów wysoko zimmunizowanych istotnie się skraca.

Wreszcie nowe techniki dają możliwość tworzenia tzw. wirtualnego PRA. Na podstawie bazy danych zawierającej wyniki oznaczeń za pomocą technik fazy stałej można wstępnie – w programie komputerowym – zawęzić liczbę potencjalnie zgodnych par dawca-biorca i dopiero na tej podstawie przeprowadzić właściwy dobór za pomocą rzeczywistych oznaczeń w pracowni HLA jedynie wśród tej wybranej grupy. Oszczędza to cenny czas potrzebny na przeprowadzenie doboru.

Wydaje mi się, że Poltransplant w miarę swoich możliwości już koordynuje takie inicjatywy. Polskie laboratoria mają niezbędny sprzęt i wiedzę, Ministerstwo Zdrowia takie programy już także ogłaszało. Potrzebne byłoby właściwie jedynie stałe coroczne finansowanie takiego programu. Właściwie nie ma dyskusji „czy”, ale raczej „jak często” takie oznaczenia powinny być wykonywane u oczekujących na przeszczep. Patrząc na tendencje na świecie, należałoby się raczej zastanowić, czy takie rutynowe oznaczenia nie powinny dotyczyć także pacjentów po przeszczepie.

Na dalszym etapie, gdy zgłoszony jest konkretny dawca, pomiędzy jego limfocytami a surowicą potencjalnych biorców wykonywany jest przed przeszczepieniem crossmatch (XM CDC), czyli próba krzyżowa (bezpośrednio między limfocytami konkretnego dawcy i surowicą konkretnego biorcy). Surowicę biorcy miesza się z limfocytami pochodzącymi od dawcy, aby dowiedzieć się, czy w układzie odpornościowym biorcy są przeciwciała przeciw antygenom dawcy, które mogą atakować nerkę dawcy po jej wszczepieniu. Dodatnia próba krzyżowa świadczy o tym, że są one obecne i organizm biorcy szybko odrzuciłby przeszczep. Przeszczepienie w takiej sytuacji nie może się odbyć. U chorych z wysokim PRA często próba krzyżowa jest dodatnia. Ponadto do tego testu kwalifikowani są tylko ci biorcy, u których nie stwierdza się tych samych niezgodnych antygenów HLA, jakie występowały w przypadku poprzedniej transplantacji. Robi się to z założenia, nie z realnej wiedzy, ponieważ test PRA nie identyfikuje klasy ani swoistości przeciwciał HLA. Zmniejsza to szansę na przeszczepienie, ponieważ taki biorca jest a priori wykluczany z realnego typowania.

W Polsce stopień immunizacji określany jest testem PRA CDC. Słabe strony tego testu to:

  • nieidentyfikowanie klasy ani swoistości przeciwciał anty-HLA,
  • czułość testu zależy od żywotności komórek i jakości komplementu (podstawa wiarygodności testu CDC),
  • niski odsetek limfocytów B we krwi obwodowej sprawia, że słabo wykrywalne są przeciwciała anty-HLA klasy II,
  • wynik zależny od panelu dawców,
  • wyniki mogą być fałszywie pozytywne i fałszywie negatywne.


Oznacza to, że testy PRC wykonywane dotychczasowymi metodami nie oceniają w sposób odpowiedni statusu immunologicznego biorcy. Testy fałszywie ujemne są wręcz niebezpieczne, ponieważ mogą wprowadzić w błąd klinicystę zlecającego leczenie immunosupresyjne u chorego do kolejnej transplantacji. Immunosupresja może być za słaba i istnieje ryzyko odrzucania nerki. W pilotażowych badaniach wykazano, że u pacjentów zgłoszonych do kolejnej transplantacji, u których test PRA wykonany testami rutynowo stosowanymi w Polsce (PRA CDC) wynosił 0, przebadanie tych samych, bieżących próbek surowic wysokoczułym testem fazy stałej wykazało, że odsetek pacjentów uczulonych był znacznie wyższy i wynosił 96 proc.

Prof. dr hab. med. Magdalena Durlik, kierownik Kliniki Medycyny Transplantacyjnej i Nefrologii Instytutu Transplantologii WUM, mazowiecki konsultant w dziedzinie nefrologii

Nowoczesne metody oznaczania uczulenia biorcy wobec antygenów dawcy są bardziej czułe i swoiste – pozwalają dokładnie określić, przeciwko którym antygenom zgodności tkankowej dawcy potencjalny biorca wytwarza przeciwciała. Pacjenci wysoko immunizowani dłużej czekają na przeszczep, a nawet gdy przejdą serologiczną próbę krzyżową, istnieje u nich zwiększone ryzyko procesu ostrego odrzucania i obserwuje się krótsze przeżycie przeszczepu nerkowego. Nowe metody pozwalają na podstawie stężenia oznaczonych przeciwciał arbitralnie eliminować biorców o najwyższych wartościach i w ten sposób nie narażać ich na niepowodzenie zabiegu transplantacji. W Polsce przyjęliśmy tę linię odcięcia na poziomie MFI > 5000.

W praktyce wielokrotnie przekonaliśmy się, że pacjent z PRA 0 proc., u którego obserwowaliśmy intensywny proces odrzucania przeszczepu, tak naprawdę był chorym wysoko uczulonym i dzięki nowym technikom powinien mieć lepiej dobrany przeszczep. Z kolei pacjent z PRA 0 proc. wielokrotnie nie przechodził w próbie krzyżowej (a przecież powinien mieć wynik ujemny) i tu też nowe techniki potwierdziły wysoki stopień uczulenia, który nie był wykrywany w testach serologicznych. Zmiany organizacyjne nie są potrzebne, bo pracownie typowania tkankowego wyposażone są w odpowiedni sprzęt do wykonywania testów fazy stałej, potrzebne są jedynie pieniądze na zakup odczynników. Finansowanie powinno mieć charakter stały, tak aby zapewnić ciągłość oznaczeń co trzy-cztery miesiące i wyeliminować metody serologiczne, które są znacznie mniej dokładne. Pilotażowe badania finansowane z Narodowego Programu Rozwoju Medycyny Transplantacyjnej potwierdziły, że nasze pracowanie są przygotowane do rutynowego wykonywania testów fazy stałej. Podkreślę, że testy fazy stałej potrzebne są nie tylko przed transplantacją nerki, ale na świecie stosuje się je do monitorowania immunologicznego biorcy w celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności przeciwciał przeciwko antygenom zgodności tkankowej dawcy, które utrzymują się po transplantacji lub powstają de novo i są odpowiedzialne za proces odrzucania humoralnego, który jest uważany za wiodącą przyczynę późnej utraty przeszczepu.

W większości krajów europejskich, a także w USA i Brazylii stosuje się obecnie rutynowo metodę znacznie nowocześniejszą – wysokoczułe testy fazy stałej (solid phase assay – SPA) z wykorzystaniem fluorymetru. Urządzenie to jest powszechnie dostępne w laboratoriach immunologicznych w Polsce. Przebadanie surowic pacjentów pozwala wykryć chorych z obecnością przeciwciał, nie identyfikuje jednak ich klasy i swoistości. Jednak selekcjonuje grupę chorych, u których wskazane jest wykonanie badań testem identyfikującym rodzaj przeciwciał i ich miano. Jest to bardzo ważne dla chorych z dwóch powodów:

1. Pozwala na uniknięcie przeszczepienia narządu od dawcy z nieakceptowalnymi niezgodnościami, czyli w sytuacji, gdy w surowicy biorcy są przeciwciała przeciw antygenom dawcy.

2. Nieeliminowanie chorych bez przeciwciał przeciw wcześniejszym niezgodnym antygenom. W Polsce przy doborze do kolejnej transplantacji nie kwalifikuje się do typowania biorcy (realny crossmatch) w przypadku obecności u kolejnego dawcy tych samych niezgodnych antygenów, jakie były u poprzednich dawców. Zakłada się bowiem, że ma on w swojej surowicy przeciwciała przeciw tym antygenom powstałe przy poprzednim przeszczepieniu. Jednak to założenie nie zawsze jest słuszne (wykazano to testami fazy stałej). Czasami tych przeciwciał nie ma, a wykluczanie biorcy z typowania z dawcą z takimi antygenami zmniejsza a priori szansę na kolejne przeszczepienie. Czas oczekiwania na kolejne przeszczepienie bardzo się wydłuża.


Wykonanie oceny immunologicznej biorcy testami fazy stałej umożliwia zatem lepszy dobór pomiędzy dawcą i biorcą. W przypadku chorych uczulonych z jednej strony zmniejsza to ryzyko odrzucenia, a z drugiej może skrócić czas oczekiwania na kolejną transplantację.

Dokładna ocena immunologiczna pozwala na wykorzystanie tzw. wirtualnego PRA (vPRA) i wirtualnego crossmatch (vXM). Znając antygeny HLA z dużych populacji (np. Polska) i dokładny panel przeciwciał przeciw konkretnym antygenom HLA u biorcy, można zastosować specjalne programy informatyczne (vPRA i vXM), które pozwalają wytypować odpowiedni organ, w stosunku do którego biorca nie wytwarza przeciwciał. Taki vXM jest dużo dokładniejszy niż tradycyjny, pozwala lepiej oszacować ryzyko i wykluczyć przeszczepienie od osoby mającej antygeny, na które biorca wytwarza przeciwciała. Przed transplantacją vXM jest potwierdzany XM CDC, czyli realnym badaniem reakcji limfocytów dawcy z surowicą biorcy.

Metody fazy stałej umożliwiające stosowanie vPRA i vXM nie są jednak jest dotąd w Polsce rutynowo stosowane. Dopiero w ubiegłych latach, dzięki finansowaniu w ramach Programu Rozwoju Medycyny Transplantacyjnej, metodą testów fazy stałej Poltransplant przebadał 1400 biorców, czyli wszystkie osoby figurujące na liście oczekujących.

– Widzimy różnicę między metodą starą i nową. Przy pierwszej poziom immunizacji pacjentów w wielu przypadkach był znacznie niedoszacowany. Zdarzało się, że próba krzyżowa dawała ujemny wynik i dochodziło do przeszczepu, a dopiero badania nowoczesną metodą pokazywały, że ryzyko tego przeszczepienia było wyższe, niż wynikało to z tradycyjnych badań, ponieważ biorca wytwarzał przeciwciała przeciwko antygenom dawcy – mówi prof. Danielewicz. – Przewaga nowej metody polega na tym, że pozwala nam uniknąć wielu przeszczepów z góry spisanych na niepowodzenie. Zapewni to dłuższe przeżycie przeszczepów i mniejszy odsetek odrzucenia narządów. Z drugiej strony skróci oczekiwanie na przeszczepienie chorym, którzy nie mają w swojej surowicy przeciwciał przeciw antygenom dawcy, a byli wykluczani z typowania tylko dlatego, że powtarzały się te same niezgodne antygeny u potencjalnego kolejnego dawcy.

W ocenie prof. Danielewicza projekt pokazał, że zarówno ośrodki przeszczepiania, jak i laboratoria są przygotowane do rutynowego wdrożenia tej metody. Postuluje objęcie cyklicznymi badaniami wszystkich oczekujących.

Obecnie, w ramach projektu, testy fazy stałej nie są jednak wykonywane w sposób ciągły, a ich wyniki można wykorzystywać jedynie przez trzy-cztery miesiące po wykonaniu.

Poltransplant będzie występował do resortu zdrowia o zwiększenie środków na ten cel, aby można było wprowadzić nowoczesne techniki do rutynowego stosowania, a to wymaga dodatkowych środków.