Prof. dr hab. med. Paweł Krawczyk

Komórki dendrytyczne (dendritic cells – DCs) należą do komórek prezentujących antygen (antigen presenting cells – APC). Pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym i różnicują się z progenitorów granulocytów i makrofagów. Jako jedyne spośród APCs wykazują ekspresję zarówno cząsteczek MHC klasy I (major histocompatibility complex class I), jak i MHC klasy II, posiadając tym samym zdolność do bezpośredniej prezentacji antygenów limfocytom T cytotoksycznym i pomocniczym. Występują zarówno w węzłach chłonnych i śledzionie, jak i w większości tkanek organizmu.[1,2]

Komórki dendrytyczne zostały odkryte przez Steinmana i Cohna w mysiej śledzionie. Wcześniej Langerhans opisał morfologię komórek dendrytycznych w skórze, błędnie interpretując ich wygląd i przypisując je do komórek układu nerwowego. Oprócz charakterystycznej morfologii (wypustki cytoplazmy) komórki dendrytyczne charakteryzuje wysoka ekspresja cząsteczek MHC klasy I i II oraz wysoka zdolność do aktywacji różnych subpopulacji limfocytów T dzięki obecności na ich powierzchni cząsteczek kostymulujących (immunologiczne punkty kontroli). W związku ze skomplikowaną funkcją DCs trudno jest na podstawie ekspresji antygenów powierzchniowych zdefiniować ich subpopulacje.[1,2,3]

DCs występujące we krwi obwodowej definiowane są jako leukocyty pozbawione markerów (cluster of differentiation – CD) charakterystycznych dla limfocytów (CD3-, CD19-, CD20-, CD56-) i monocytów (CD14-, CD16-). Klasyczny podział komórek dendrytycznych krwi obwodowej obejmuje mieloidalne DCs oraz plazmocytoidalne DCs i został stworzony na podstawie oceny ich fenotypu (ekspresji specyficznych antygenów powierzchniowych). Komórki te mogą występować także w węzłach chłonnych, innych narządach limfatycznych oraz tkankach obwodowych. W skórze natomiast występują skórne DCs i komórki Langerhansa, które przez niektórych naukowców z uwagi na występowanie na ich powierzchni antygenu CD14 uznawane są za makrofagi. Bardziej przekonujący jest podział funkcjonalny DCs, który w dużym uproszczeniu obejmuje DCs klasy 1 i 2. DC1 wykazują ekspresję antygenu CD141 i są odpowiedzialne za prezentację egzogennych antygenów, w tym antygenów wirusowych i nowotworowych poprzez cząsteczki MHC klasy I. Funkcją DC1 jest pobudzenie odpowiedzi komórkowej poprzez aktywację limfocytów T pomocniczych typu 1 (T helper lymphocyte type 1 – Th1). DC2 wykazują ekspresję antygenu CD1c (niektóre mogą mieć ekspresję antygenu CD1c i CD141) i są odpowiedzialne za prezentację antygenów pochodzących z zewnątrzkomórkowych patogenów i alergenów. W zależności od obecności na ich powierzchni cząsteczek kostymulujących DC2 mogą stymulować różnicowanie limfocytów do komórek Th17, T regulatorowych (Treg) lub Th2. W związku z tym DC2 odpowiedzialne są za indukcję immunologicznej odpowiedzi humoralnej, ale także za rozwój alergii i immunosupresji. Skórne DCs z ekspresją antygenu CD14 są najczęściej odpowiedzialne za rozwój zjawiska immunotolerancji na różne patogeny, natomiast komórki Langerhansa wykazują zdolność do stymulacji różnych subpopulacji limfocytów.[2,3]

W konstrukcji szczepionek przeciwnowotworowych istotne jest otrzymanie w hodowlach komórkowych populacji komórek DC1 z wysoką ekspresją cząsteczek prezentujących antygen oraz cząsteczek kostymulujących, powodujących indukcję odpowiedzi komórkowej i swoistą aktywację limfocytów Th1. Warunkiem takiego działania jest wywołanie na powierzchni DCs ekspresji takich cząsteczek jak: CD83 (marker dojrzałości DCs), CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2). Cząsteczki CD80 i CD86, łącząc się z antygenem CD28 na powierzchni komórek T, indukują drugi sygnał do aktywacji i proliferacji limfocytów (pierwszym sygnałem jest rozpoznanie antygenów prezentowanych na cząsteczkach MHC przez receptory limfocytów T – TCR). Jednak cząsteczki CD80 i CD86 mogą także łączyć się z cząsteczką CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4). Wówczas dochodzi do zahamowania funkcji limfocytów Th oraz pobudzenia limfocytów Treg, co w efekcie doprowadza do wygaszenia odpowiedzi immunologicznej. Komórki dendrytyczne w wyniku pochłonięcia odpowiednich antygenów wytwarzają także szereg cytokin, których proporcja aktywuje różne populacje limfocytów T (trzeci sygnał indukcji odpowiedzi immunologicznej).[2,4]

Zasady immunoterapii z wykorzystaniem komórek dendrytycznych

Immunoterapia adoptywna chorób nowotworowych polega na modyfikacji autologicznych (rzadziej allogenicznych) komórek immunologicznych poza organizmem pacjenta, a następnie podaniu ich zwrotnie choremu. Modyfikacja komórek immunologicznych w hodowlach komórkowych lub metodami inżynierii genetycznej polega na aktywacji tych komórek za pomocą cytokin (np. limfocyty naciekające guz, limfocyty aktywowane limfokinami), stworzeniu limfocytów mających chimeryczne receptory dla antygenów nowotworowych (chimeric antigen receptors – CARs) lub swoistej stymulacji za pomocą antygenów nowotworowych (komórki dendrytyczne). Tak zmodyfikowane komórki immunologiczne mają być zdolne do bezpośredniego zabicia komórek nowotworowych lub skutecznej prezentacji antygenów nowotworowych limfocytom, które uzyskają następnie taką zdolność. Stworzenie szczepionki przeciwnowotworowej składającej się z limfocytów czy komórek dendrytycznych wymaga skomplikowanych, długotrwałych i kosztownych procedur laboratoryjnych. Zazwyczaj powstanie każdej dawki szczepionki poprzedza żmudne jej przygotowanie, co wymaga stałej obecności zespołu składającego się z immunologów i onkologów klinicznych. Ponadto wymagana jest czasami stała obecność pacjenta, od którego pobierane są komórki immunologiczne, które po modyfikacji są mu ponownie podawane, a skuteczność terapii jest monitorowana zarówno na poziomie klinicznym, jak i immunologicznym.[4]

Ze względu na swoje silne zdolności do prezentacji antygenu limfocytom T komórki dendrytyczne znalazły zastosowanie jako szczepionki przeciwnowotworowe. Jednak we krwi obwodowej odsetek DCs wśród leukocytów nie przekracza 1 proc. Nieco więcej komórek dendrytycznych można odszukać w węzłach chłonnych i niektórych innych narządach, zwłaszcza tych narażonych na kontakt z patogenami bakteryjnymi czy wirusowymi. W celu uzyskania dojrzałych komórek dendrytycznych w hodowlach komórkowych konieczne jest określenie i izolacja komórek prekursorowych, które mogą przekształcić się w DCs pod wpływem stymulacji cytokinami. Jako komórki prekursorowe wykorzystuje się najczęściej monocyty krwi obwodowej. Niewielką liczbę czystej populacji monocytów można uzyskać za pomocą sortowania wyizolowanych komórek mononuklearnych krwi obwodowej z użyciem odpowiednio przygotowanych przeciwciał w cytometrze przepływowym lub w polu magnetycznym. Jednak w celu jednoczasowego przygotowania kilku lub kilkunastu dawek szczepionki konieczne jest pobranie dużej liczby monocytów, np. w drodze leukaferezy. Prekursorami komórek dendrytycznych mogą być także makrofagi i komórki macierzyste, chociaż w pierwszym przypadku trudno doprowadzić do powstania DCs, a w drugim liczba komórek może nie być wystarczająca do efektywnej generacji DCs.[4-10]

Tak pobrane i wyizolowane monocyty lub komórki macierzyste umieszcza się w specjalnym podłożu hodowlanym i rozpoczyna się ich różnicowanie w niedojrzałe komórki dendrytyczne pod wpływem cytokin. Najczęściej w tym celu wykorzystuje się GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) i interleukinę 4 (IL-4). Różnicowanie trwa od pięciu do siedmiu dni. Natomiast dojrzałość komórek dendrytycznych uzyskuje się w trakcie ich końcowej inkubacji z TNF-αα (tumor necrosis factor alfa). Czasami uzyskanie dojrzałych komórek dendrytycznych może wymagać stymulacji dodatkowymi cytokinami i immunomodulatorami, takimi jak:

• IL-1β,
• IL-6,
• prostaglandyna E2 (PGE2),
• agoniści receptorów toll-like (TLR).[5-10]

Dojrzałe komórki dendrytyczne są przygotowane do prezentacji antygenów. W tym celu na zakończenie hodowli in vitro należy je uczulić odpowiednimi syntetycznymi epitopami antygenów nowotworowych. Są to najczęściej krótkie fragmenty oligopeptydowe, które we wnętrzu komórki dendrytycznej nie muszą przechodzić procesu chemicznej obróbki, takich jak ubikwitynacja i działalność enzymów proteolitycznych, lecz trafiają w drodze pinocytozy bezpośrednio do siateczki śródplazmatycznej, gdzie są łączone z cząsteczkami prezentującymi antygen zarówno klasy I, jak i II. Wśród peptydów wykorzystywanych najczęściej do swoistej stymulacji DCs należy wymienić:

• kwaśną fosfatazę sterczową,
• antygen karcinoembrionalny,
• antygen guza Wilmsa,
• HER2,
• MUC-1,
• gp100,
• MART,
• MAGE,
• MUC-1.

Równie często stymulacji antygenowej komórek dendrytycznych dokonuje się poprzez ich ekspozycję na lizaty autologicznych komórek nowotworowych lub ciałka apoptotyczne wytworzone w trakcie hodowli komórek nowotworowych w niekorzystnych warunkach. W tym celu można wykorzystać także allogeniczne linie komórek nowotworowych. Za pomocą elektroporacji można doprowadzić także do fuzji komórek dendrytycznych i komórek nowotworowych. Proces ten wykorzystywany jest również w celu umożliwienia wniknięcia do DCs mRNA, kodującego antygeny nowotworowe. Komórki dendrytyczne mogą być także transfekowane wektorami wirusowymi zawierającymi DNA z mutacjami warunkującymi powstanie antygenów swoistych nowotworowo.[5-10]

Tak przygotowaną szczepionkę z komórek dendrytycznych podaje się chorym w postaci iniekcji:

• śródskórnych,
• podskórnych,
• dowęzłowych,
• doguzowych,
• dożylnych.

Iniekcje powtarza się wielokrotnie, najczęściej w odstępach dwutygodniowych. Istnieje wiele strategii podawania immunoterapii w połączeniu ze standardowym leczeniem systemowym. Najczęściej jednak z uwagi na nieudowodnioną wartość kliniczną szczepionek z komórek dendrytycznych podaje się je w monoterapii u chorych, którzy wyczerpali wszystkie metody leczenia systemowego (często na zasadzie eksperymentu medycznego). Rzadziej podejmowane są próby łącznego stosowania immunoterapii i chemioterapii lub immunoterapii jako uzupełnienia wcześniej zastosowanych metod leczenia (zabiegu chirurgicznego, radioterapii lub chemioterapii).[5-10]

W każdym z tych przypadków konieczne jest wnikliwe monitorowanie skuteczności leczenia za pomocą komórek dendrytycznych. Odpowiedź na leczenie monitorowana jest według klasycznych, klinicznych kryteriów RECIST (response evaluation criteria in solid tumors). Jednak z uwagi na fakt, że w przebiegu immunoterapii odpowiedź na leczenie może nie być ani tak szybka, ani tak spektakularna jak w przypadku stosowania terapii ukierunkowanych molekularnie czy chemioterapii, wprowadzono odrębne kryteria odpowiedzi związane z immunoterapią (immune-related response criteria – irRC). Nie są one jednak w powszechnym użyciu, wymagają bowiem od lekarza precyzyjnego pomiaru większości zmian mierzalnych oraz szerokich i częstych badań obrazowych (głównie tomografii komputerowej). W niemal wszystkich badaniach z zastosowaniem preparatów zawierających komórki dendrytyczne monitorowany jest także stan układu immunologicznego. Najprostszym badaniem są testy skórne z antygenami nowotworowymi wykorzystanymi do stymulacji DCs (delayed-type hypersensitivity – DTH). Obecność miejscowego odczynu zapalnego po kilku dniach od śródskórnego podania antygenu świadczy o rozwoju swoistej odpowiedzi komórkowej w organizmie immunizowanego pacjenta. W trakcie immunoterapii oceniany jest także odsetek limfocytów T regulatorowych we krwi obwodowej chorych za pomocą techniki cytometrii przepływowej. Wzrost odsetka komórek Treg, mających na powierzchni antygeny CD4 i CD25 (receptor dla IL-2) oraz czynnik transkrypcyjny FoxP3, świadczy o rozwoju zjawiska immunotolerancji i nieskuteczności immunoterapii. Z drugiej strony o skuteczności immunoterapii świadczy wzrost odsetka i liczby limfocytów T pomocniczych, wytwarzających pod wpływem stymulacji antygenowej interferon gamma (IFN-γ). Zjawisko to badane jest za pomocą cytometrii przepływowej lub techniką ELISpot (enzyme-linked immuno spot). Możliwe jest także badanie odsetka specyficznych antygenowo limfocytów T cytotoksycznych we krwi obwodowej za pomocą techniki cytometrii przepływowej z wykorzystaniem syntetycznych tetramerów. Tetramery składają się z czterech cząsteczek MHC klasy I połączonych z badanymi antygenami oraz odpowiednimi fluorochromami. Limfocyty T cytotoksyczne, rozpoznając antygeny prezentowane przez MHC klasy I, przyłączają tetrametry.[5-10]

Terapia wykorzystująca komórki dendrytyczne (zwłaszcza autologiczne) ma zazwyczaj niewielkie działania niepożądane. Pierwszy problem dotyczy jakości prowadzonych hodowli mających na celu wygenerowanie dojrzałych i swoistych DCs. Z uwagi na skomplikowany i długotrwały proces hodowli możliwe są liczne błędy laboratoryjne. Komórki dendrytyczne mogą nie zostać prawidłowo wygenerowane lub ich liczba może być niewystarczająca. W celu uniknięcia tego problemu fenotyp DCs powinien być sprawdzany przy użyciu cytometrii przepływowej przed każdym podaniem immunoterapii. Istnieje także ryzyko zanieczyszczenia hodowli drobnoustrojami i wywołania infekcji w miejscu podania lub nawet ogólnoustrojowej. W przypadku uczulania DCs syntetycznymi peptydami może dojść do odczynów alergicznych w miejscu podania lub objawów ogólnoustrojowych: wysypki, stanów podgorączkowych i bólów stawowych. Niezmiernie rzadko zdarzają się poważne wstrząsy anafilaktyczne, zwłaszcza w przypadku wykorzystywania komórek allogenicznych.[5-12]