Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna oparta na wolnym DNA płodowym obecnym we krwi matki

Wiele lat badań naukowych poświęcono próbom identyfikacji komórek płodowych w krążeniu matki jako potencjalnego źródła materiału pochodzenia płodowego, który mógłby posłużyć dla celów bezpieczniejszej diagnostyki nieinwazyjnej (non-invasive prenatal diagnosis, NIPD). Dzisiaj wiadomo, że ze względu na zbyt małą ilość tych komórek oraz brak wiarygodnych metod ich analizy ta strategia ma małe szanse na szersze zastosowanie kliniczne. W 1997 roku Lo i wsp. zidentyfikowali w krążeniu ciężarnych pozakomórkowe, wolne DNA płodowe (cell-free fetal DNA, cffDNA). Pochodzi ono z łożyska i może być wykrywane już od czwartego tygodnia ciąży, jest szybko usuwane z krwiobiegu po porodzie, co czyni je potencjalnym źródłem materiału pochodzenia płodowego do diagnostyki prenatalnej. Ogromna większość pozakomórkowego DNA w krążeniu pochodzi od matki, materiał płodowy stanowi zaledwie 3% we wczesnej ciąży i dochodzi do 6% w terminie porodu. Obecnie stosowane metody nie pozwalają na całkowite odseparowanie DNA matczynego od płodowego, stąd diagnostyka opiera się na wykryciu lub wykluczeniu obecności genów nieobecnych u matki, takich jak sekwencje charakterystyczne dla chromosomu Y czy allel D czynnika Rh u kobiety Rh ujemnej. Po wyizolowaniu całkowitego cffDNA, w celu amplifikacji konkretnego genu, na przykład RHD u kobiety Rh ujemnej czy SRY lub DYS14 w przypadku identyfikacji płci, wykorzystuje się wysoce czułą metodę reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction, PCR), określaną jako PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Sygnał pozytywny oznaczałby, że płód jest Rh(+), lub że płód jest płci męskiej, brak sygnału wskazywałby, że płód nie ma badanego genu, czyli że jest odpowiednio Rh(-) lub jest dziewczynką. Brak sygnału może jednak oznaczać także niepowodzenie amplifikacji płodowego DNA, dlatego trwają intensywne badania nad określeniem uniwersalnych markerów płodowych, które mogłyby być wykorzystane jako standardy laboratoryjne.

2. Typowanie płodowego RHD

Od 2001 roku typowanie płodowego RHD przy wykorzystaniu cffDNA stosowane jest w prowadzeniu ciężarnych obarczonych dużym ryzykiem choroby hemolitycznej noworodka (HDN-c) spowodowanym ciążą z konfliktem serologicznym w wywiadzie lub podwyższonym mianem przeciwciał. W Wielkiej Brytanii niemal całkowicie zastąpiło ono amniopunkcję oraz biopsję kosmówki. Ta metoda jest pracochłonna, ale wiele grup badawczych potwierdziło jej dużą dokładność. Wykorzystanie tej metody opisano także w odniesieniu do określania płodowych antygenów RhC, c,E i Kell. W ostatnim czasie International Blood Group Reference Laboratory w Bristolu doniosło o skutecznym zastosowaniu wysoce wydajnej metody opartej na zautomatyzowanych technikach, potencjalnie nadającej się do masowych przesiewowych badań wszystkich kobiet Rh ujemnych. Metodę tę wykorzystano w określeniu płodowego antygenu D czynnika Rh u 1788 Rh ujemnych kobiet w 28 tygodniu ciąży. W porównaniu z serologicznym typowaniem Rh u płodów po urodzeniu dokładność metody określono na 95,7%, a wskaźnik wyników fałszywie ujemnych wyniósł 0,2%. Jeżeli potwierdzi się skuteczność tej metody także we wczesnej ciąży, przy czym należy pamiętać, że względna proporcja cffDNA jest mniejsza w początkowych tygodniach ciąży, będzie to potencjalny sposób ograniczenia stosowania immunoglobuliny anty-D u kobiet Rh ujemnych, których dziecko jest również Rh ujemne.