Określanie antygenów u matki, ojca, dziecka i płodu wykonuje się, wykorzystując metody serologiczne oraz analizę DNA (tab. 2). Do badań serologicznych wykorzystuje się przeciwciała skierowane przeciw poszczególnym antygenom płytek. Są one trudne technicznie i mają wiele ograniczeń wynikających przede wszystkim z braku surowic diagnostycznych zawierających swoiste przeciwciała czy niedostatecznej liczby płytek do badań, jak w przypadku osób z małopłytkowością. Dlatego badania serologiczne uzupełnia się (w przypadku najcięższego konfliktu w układzie HPA1) lub nawet zastępuje (w pozostałych konfliktach) badaniami molekularnymi. Te badania stosowane są w Polsce od lat 90. XX wieku.^11,12 Niewątpliwą zaletą badań serologicznych jest wykrywanie dzięki nim antygenu znajdującego się faktycznie na płytkach.

Metodami molekularnymi badamy DNA kodujący sekwencje aminokwasów w białkach, które są nośnikami antygenów płytkowych i na tej postawie wnioskujemy o obecności antygenu. Materiałem do badań jest na ogół krew obwodowa, ale badanie może być też wykonane praktycznie z każdego materiału, w którym znajduje się DNA, czyli komórki jądrzaste. Może to być materiał pobrany podczas kordocentezy i amniopunkcji, a także z wszelkich wymazów z jam ciała. Niezwykle istotny jest sposób pobierania materiału, aby nie spowodować wzajemnego zanieczyszczenia próbek. Małopłytkowość nie stanowi czynnika ograniczającego wykonanie badania na poziomie DNA. Jest to bardzo istotne, bo u osób z małopłytkowością liczba płytek jest za mała, aby wykonać badanie metodami serologicznymi. Wiarygodność wyniku badania genetycznego jest duża, ale istnieje niewielkie prawdopodobieństwo (ok. 1:1000) wystąpienia u badanej osoby polimorfizmu (występowanie „nietypowego nukleotydu” – innego niż u większości ludzi w populacji) w analizowanych fragmentach DNA, co spowoduje wynik fałszywy.

Badania molekularne cechują się bardzo wysoką czułością i w niedalekiej perspektywie będą mogły być wykorzystane do nieinwazyjnego określania HPA płodu z osocza ciężarnej. Takie badanie jest niezwykle istotne w przypadku występowania u kobiety swoistych przeciwciał przeciwpłytkowych. Przeciwciała te nie są groźne dla płodu, jeśli nie odziedziczył on od ojca niezgodnego antygenu, przeciwko któremu skierowane są przeciwciała obecne u matki.

Badania przeciwciał w diagnostyce AIMP/N

Wykrycie przeciwciał przeciwpłytkowych i określenie ich swoistości jest niezwykle ważne dla diagnostyki konfliktu. Badania wykonuje się za pomocą różnych testów, by zwiększyć prawdopodobieństwo ich wykrycia, ponieważ pewne przeciwciała wykrywane są tylko w niektórych testach (tab. 3). Testami stosowanymi w diagnostyce AIMP/N są: immunofluorescencji z płytkami, immunoenzymatyczny ELISA z glikoproteinami będącymi nośnikami antygenów płytek, MAIPA z użyciem monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko glikoproteinom płytkowm. Ten ostatni stanowi złoty standard w diagnostyce AIMP/N.^1,2,5,12 Metody wykrywania przeciwciał są nieustannie modyfikowane i możemy się spodziewać, że niebawem stosowane będą testy oparte na nowych technologiach.^13,14

Tabela 3. Badania przeciwciał wykorzystywane w diagnostyce AIMP/N

Ważnym etapem diagnostyki jest wykazanie reaktywności przeciwciał w stosunku do płytek izolowanych od ojca dziecka. W przypadkach, w których przeciwciała nie reagują z płytkami dawców panelowych, a reagują tylko z płytkami ojca, istnieje podejrzenie, że u ojca występuje antygen bardzo rzadko spotykany i należy wdrożyć diagnostykę w kierunku identyfikacji tego antygenu.

Po wykryciu przeciwciał należy ustalić ich swoistość. Badanie wykonuje się z panelem dawców o oznaczonych antygenach HPA lub z glikoproteinami o określonej swoistości. W piśmiennictwie dyskutowana jest wartość ilościowego badania przeciwciał dla przewidywania ciężkości konfliktu – dla ustalania zagrożenia małopłytkowością. Wielu autorów wskazuje, że takie badanie jest przydatne.

Badanie przeciwciał najczęściej, jak powiedziano wyżej, wykonuje się po ciąży podczas diagnostyki dziecka z małopłytkowością. Ma ono duże znaczenie dla kolejnej ciąży, w której można zastosować odpowiednie leczenie. Należy podkreślić, że przeciwciała mogą nie być wykryte u niektórych kobiet z konfliktem płytkowym z powodu ich małego stężenia. Mogą one być wykrywalne dopiero po kilku tygodniach po porodzie lub dopiero w następnej ciąży. Wykrycie przeciwciał jest więc ważne, ale ich niewykrycie nie przesądza o wykluczeniu AIMP/N.

Kobiety, których dzieci miały objawy sugerujące AIMP/N, u których nie wykryto przeciwciał, ale wykryto niezgodność w antygenach HPA, muszą być kierowane na diagnostykę w kierunku AIMP/N w kolejnej ciąży.

Należy też brać pod uwagę, co powiedziano wyżej, że przeciwciała nie są groźne dla płodu i nie spowodują małopłytkowości wtedy, gdy płód nie odziedziczył niezgodnego antygenu. Stwierdzić to można obecnie jedynie, wykonując kordocentezę, aby zbadać liczbę płytek i ich antygeny. Ocena antygenów jest możliwa za pomocą metod analizy DNA. Zabieg kordocentezy w przypadkach małopłytkowości u płodu jest wysoce inwazyjny. Z tej przyczyny bardzo duże nadzieje wiąże się z wprowadzeniem nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej w AIMP/N, pozwalającej na ustalenie, jakie antygeny ma płód, ponieważ przeciwciała mogą pochodzić z poprzedniej ciąży, a nie są groźne dla płodu. Takie badania są obecnie opracowywane w Polsce. Są one trudniejsze technicznie od nieinwazyjnych badań antygenu RhD, ponieważ u podłoża molekularnego przeciwstawnych antygenów płytkowych leży różnica tylko jednego nukleotydu w sekwencji kodującej w DNA matki i DNA płodu. Standaryzacja takich badań jest bardzo trudna i pracochłonna, a można jej dokonać jedynie na materiale pochodzącym od ciężarnych z konfliktem w HPA.

Konflikt w układzie HPA1 – najczęstsze podłoże AIMP/N

Podłożem AIMP/N jest najczęściej konflikt w układzie HPA1 wtedy, gdy kobieta nieposiadająca antygenu HPA1a (HPA1a ujemna, czyli HPA1bb) wytwarza przeciwciała przeciw antygenowi HPA1a, który płód odziedziczył od ojca. Konflikt ten leży u podłoża około 80-85% AIMP/N. Osoby HPA1bb stanowią około 2% w populacji kaukaskiej, a więc 2% ciężarnych jest potencjalnie narażonych na ten konflikt płytkowy. Około 74% populacji stanowią osoby heterozygotyczne HPA1ab, pozostałe 24% to homozygoty HPA1aa. Jeśli ojciec dziecka ma fenotyp HPA1aa, to każde jego dziecko „będzie w konflikcie” z HPA1a ujemną matką; jeśli jest heterozygotą to istnieje 50% szans, że dziecko nie odziedziczy niezgodnego antygenu. Określanie antygenów lub genotypu ojca ma więc istotne znaczenie dla wnioskowania o zagrożeniu konfliktem u kobiet HPA1bb (czyli HPA1a ujemnych). Niezgodność antygenu HPA1a występuje w około 1 na 350 ciąż. Nie we wszystkich z nich dochodzi do wytworzenia przez kobietę przeciwciał anty-HPA1a. Duże znaczenie rokownicze wskazujące na ryzyko alloimmunizacji ma badanie występowania u kobiety antygenu HLA DRB3*0101.^15,16 Wykazano, że jeśli u kobiety nie występuje antygen HLA DRB3*0101, to nie wytworzy przeciwciał anty-HPA1a. W Polsce przeprowadzono badania antygenów HPA1a metodą ELISA u 8013 ciężarnych.^17,18 Zidentyfikowano 144 (1,8%) kobiety HPA1a ujemne (bb). Przeciwciała anty-HPA1a wykryto u 12/122 (9,8%; 1/667 ciąż). Połowa zimmunizowanych była w pierwszej ciąży. Wszystkie kobiety z przeciwciałami były DRB3*0101 dodatnie. Ale antygen ten stwierdzono też u 29% kobiet niezimmunizowanych. Alloimmunologiczną małopłytkowość płodu lub noworodka obserwowano w 10/12 przypadków, u dwojga dzieci małopłytkowość nie wystąpiła, bo nie odziedziczyły one od ojca niezgodnego antygenu (były takie jak matka HPA1bb). Głęboka małopłytkowość wystąpiła u 4/12 dzieci (33%) urodzonych przez matki z przeciwciałami.

Przeglądowe badania antygenów układu HPA1 pozwalające na wykrycie zagrożenia najczęstszym i najpoważniejszym konfliktem płytkowym

Biorąc pod uwagę, że najczęstszym podłożem AIMP/N są przeciwciała przeciwko antygenowi HPA1a wytwarzane przez kobiety HPA1a ujemne (czyli HPA1bb) i że w około 1/1000 ciąż te przeciwciała mogą prowadzić do AIMP/N, rozważa się na świecie wprowadzenie przeglądowych badań antygenu HPA1a u ciężarnych. Badania takie wprowadzono w Norwegii.¹⁹ Identyfikują one kobiety zagrożone konfliktem w HPA1a. Ciąże u kobiet HPA1bb są monitorowane w kierunku AIMP/N (tab. 4).

Tabela 4. Badania przeglądowe w celu identyfikacji kobiet HPA1a ujemnych

Badania przeglądowe HPA1a można wykonać metodami biologii molekularnej. Przy badaniach masowych, dzięki automatyzacji, można zredukować koszt do kilkudziesięciu złotych. DNA izoluje się z niewielkiej próbki krwi pobranej na EDTA – tak jak na morfologię, przy czym nie może to być próbka, z której uprzednio wykonano inne badania (bo nie może być zanieczyszczona materiałem od innej osoby przeniesionym np. przez igłę automatu do badań morfologii). Próbki na badania molekularne mogą być zamrożone i przesyłane do badań w większych partiach, co obniża koszty transportu.