Dostęp Otwarty

Nieinwazyjna diagnostyka płodu. Obietnice a praktyka

Joe Leigh Simpson, MD

Dr Simpson, senior vicepresident, Research and Global Programs, March of Dimes Foundation, White Plains, Nowy Jork. Jest także członkiem kolegium redakcyjnego Contemporary OB/GYN. Nie zgłasza konfliktu interesów w związku z treścią poniższego artykułu.

Ginekologia po Dyplomie 2013;15 (2): 37-45

Do zapamiętania
• Nauka dotycząca prenatalnej diagnostyki genetycznej rozwija się w tempie, które jeszcze kilka lat temu było nie do wyobrażenia.
• Analizę pozakomórkowego DNA płodu cechuje bardzo wysoki wskaźnik wykrywalności trisomii 21: 99 lub 100%.

Wiarygodna nieinwazyjna diagnostyka aberracji chromosomowych płodu, która mogłaby zastąpić inwazyjne procedury, takie jak biopsja kosmówki czy amniopunkcja, od dawna była „świętym Graalem” położnictwa. Wygląda na to, że obecnie możliwa jest prenatalna diagnostyka genetyczna oparta na analizie pozakomórkowego DNA płodu obecnego we krwi matki.

Możliwość analizy pozakomórkowego DNA płodu izolowanego z krwi matki oraz jej potencjalne zastosowanie zostały po raz pierwszy opisane 15 lat temu.1 Praca Kitzmana i wsp., opublikowana w czerwcu 2012 roku, w której autorzy donoszą o nieinwazyjnym zsekwencjonowaniu całego genomu 18,5-tygodniowego płodu przy wykorzystaniu próbek krwi matki oraz śliny ojca, nadała tej technologii nowy wymiar, czyniąc z metody wykrywania aberracji chromosomowych czy chorób monogenowych diagnostykę prenatalną całego genomu płodu, uwzględniającą choroby dziedziczone recesywnie lub dominująco zgodnie z genetyką mendlowską.2

Badania przesiewowe i rzeczywiste wykrywanie trisomii na podstawie badania pozakomórkowego DNA płodu obecnego we krwi matki początkowo opierały się na analizach próbek pochodzących z ciąż, w których płód był dotknięty trisomią oraz ciąż, w których płód był zdrowy.3-5

W 2011 i następnie w 2012 roku pojawiły się doniesienia o analizie próbek krwi matek, u których wykonywano jednocześnie tradycyjne badania inwazyjne w postaci biopsji kosmówki lub analizy płynu owodniowego uzyskanego podczas amniopunkcji.6-11 Wyniki okazały się zachęcające. Wstępne doniesienia dotyczyły kobiet już zakwalifikowanych do biopsji kosmówki lub amniopunkcji (w ciążach dużego ryzyka), a próbki krwi pobierano przed wykonaniem procedury inwazyjnej. Ostatnio w podobnie przeprowadzonym badaniu odnotowano równie korzystne wyniki w grupie młodszych kobiet (średnia wieku 31,8 roku), która lepiej odzwierciedla ogólną populację ciężarnych (populacja małego ryzyka).10

Nie jest nadużyciem stwierdzenie, że nauka dotycząca prenatalnej diagnostyki genetycznej rozwija się w tempie, które jeszcze kilka lat temu było nie do wyobrażenia. Dla ginekologów położników wyzwaniem jest nie tyle śledzenie aktualnego piśmiennictwa technicznego, ile ocena przydatności nowych metod w opiece nad pacjentką oraz dowodów potwierdzających ich zastosowanie w klinice.

Wykrywanie trisomii 18 i 21: początki

Ponad 20 lat temu nasz zespół znalazł się wśród pionierów wykrywania trisomii u płodu metodą analizy jądrzastych krwinek czerwonych płodu izolowanych z krwi matki. Do analizy wykorzystywano technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) z zastosowaniem sond swoistych dla poszczególnych chromosomów.12 Bianchi i wsp. w 1992 i Gänshirt-Ahlert i wsp. w 1993 roku potwierdzili wyniki uzyskane przez nasz zespół.13,14

Po publikacji w 1993 roku szczegółowej pracy poświęconej aspektom technicznym metody wydawało się, że jej kliniczne zastosowanie jest nieuchronne.15 Niestety, okazało się, że pozyskiwanie komórek płodowych w celach diagnostycznych wymagało zastosowania metody izolowania komórek aktywowanych fluorescencją (fluorescence-activated cell sorting) lub magnetycznie (magnetic-activated cel sorting). Obie techniki są pracochłonne i mało powtarzalne. Mimo to w wieloośrodkowym badaniu sponsorowanym przez National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) poświęconym wykrywaniu trisomii 21 u płodów czułość metody wyniosła 74%.16

Pozakomórkowe DNA płodu

Zważywszy na trudności związane z pozyskiwaniem płodowych krwinek czerwonych i wprowadzeniem tej metody do praktyki klinicznej, uwaga naukowców została skierowana na pozakomórkowe DNA pochodzenia płodowego, które znajduje się w osoczu ciężarnych, zmieszane z pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego.1 Wykrycie sekwencji DNA swoistych dla chromosomu Y we krwi matki potwierdziło pochodzenie materiału genetycznego od płodu płci męskiej, dzięki czemu udowodniono zasadność i skuteczność zastosowania tej metody.

We wspomnianym wcześniej badaniu NICHD16 wykrycie sekwencji swoistych dla chromosomu Y było warunkiem sine qua non potwierdzenia obecności nienaruszonych komórek pochodzenia płodowego (płodów płci męskiej). Stwierdzenie jakościowej różnicy w DNA pochodzenia matczynego i płodowego nie stanowi trudności w sytuacjach, kiedy mamy do czynienia z sekwencjami swoistymi wyłącznie dla płci męskiej (jak w przypadku sekwencji DNA charakterystycznych dla chromosomu Y) obecnymi we krwi matki, co jednoznacznie wskazuje na płodowe pochodzenie DNA odziedziczonego po ojcu. Takie podejście – oparte na wykrywaniu jakościowych różnic w pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego i płodowego – szybko znalazło zastosowanie w wykrywaniu u płodu mutacji materiału genetycznego pochodzących od ojca.17

Szczególnego znaczenia w położnictwie nabrała możliwość nieinwazyjnego wykrywania allelu Rh (D) pochodzenia ojcowskiego, który odziedziczył płód. Jest to szczególnie ważne u par, w których ojciec jest heterozygotą w układzie Rh, natomiast matka jest Rh ujemną homozygotą. Obecnie wykorzystanie pozakomórkowego DNA pochodzenia płodowego w celu określenia wskazań do podawania immunoglobuliny anty-D Rh ujemnym ciężarnym jest strategią szeroko akceptowaną w Europie.18

Wykrywanie trisomii u płodu na podstawie badania pozakomórkowego DNA

Wziąwszy pod uwagę, że płodowe DNA stanowi zaledwie 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, wykrywanie trisomii płodowych na podstawie jego analizy jest znacznie trudniejsze niż wykrywanie chorób monogenowych pochodzenia ojcowskiego. W przeciwieństwie do wykrywania różnic jakościowych omówionych powyżej diagnostyka trisomii wymaga wykrycia ilościowych różnic w DNA w ciążach dotkniętych trisomią płodu i ciążach prawidłowych, co wynika z faktu, że zarówno matka, jak i płód mają sekwencje DNA swoiste dla chromosomu 21.

Rozróżnienie ciąży, w której płód obciążony jest trisomią, od ciąży prawidłowej jest możliwe dzięki temu, że płód z trisomią 21 ma więcej sekwencji DNA swoistych dla chromosomu 21 niż płód zdrowy. Płód z trisomią 21 zamiast dwóch ma 3 chromosomy 21 pary. Ta niewielka, ale istotna różnica w całkowitej ilości sekwencji DNA swoistych dla chromosmu 21 obecnych we krwi matki jest możliwa do wykrycia. Zakładając, że DNA pochodzenia płodowego stanowi około 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, w próbce krwi ciężarnej, której płód ma trisomię chromosomu 21, powinno być 2,5% więcej sekwencji DNA swoistych dla tego chromosomu niż w przypadku ciężarnej, której płód jest zdrowy. Ta niewielka, ale istotna różnica stanowi podstawę wykrywania trisomii (aneuploidii) opartego na analizie krwi matki. W tym celu wykorzystywane są dwie metody.

Równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA

Jedną z technologii, stosowaną w Stanach Zjednoczonych przez Sequenom (San Diego, Kalifornia) oraz Verinata Health (Redwood City, Kalifornia), jest równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA (massively parallel genomic sequencing, MPGS). W tej metodzie sekwencjonowaniu poddawana jest cała pula pozakomórkowego DNA (pochodzenia matczynego i płodowego). Spośród około 25 milionów sekwencji ocenie ilościowej podlegają te swoiste dla badanych chromosomów (21, 13, 18) i porównywane są z liczbą spodziewaną w przypadku diploidii.

Dotychczas ukazało się kilka doniesień poświęconych próbom ustalenia wartości progowych na podstawie badania wcześniej zdeponowanych próbek krwi ciężarnych. W pracy Chiu i wsp.8 opublikowanej w 2011 roku spośród 576 zbadanych próbek osocza w 7% przypadków nie zdołano uzyskać wyniku, jednak wśród pozostałych próbek wykryto wszystkie 86 przypadków trisomii 21. Także w 2011 roku Ehrich i wsp. donieśli o prawidłowym zdiagnozowaniu wszystkich 39 przypadków trisomii obecnych wśród 449 analizowanych próbek osocza ciężarnych.7 Nie odnotowano wyników fałszywie dodatnich.