W 2012 roku Bianchi i wsp. pracujący w Verinata w analizowanym materiale wykryli wszystkie z 89 przypadków ciąż dotkniętych trisomią 21.⁸ Spośród wszystkich analizowanych próbek w 3% przypadków nie zdołano wyizolować wystarczającej ilości pozakomórkowego DNA. Dzięki zastosowanej metodzie wykryli także 35 z 36 przypadków trisomii 18 oraz 11 z 14 przypadków trisomii 13. Nie odnotowano fałszywie dodatnich wyników dla trisomii chromosomów autosomalnych. Także w 2012 roku naukowcy niemieccy donieśli o skutecznym zastosowaniu równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA techniką opisaną uprzednio przez Chiu,⁶ co pozwoliło prawidłowo zidentyfikować wszystkie 8 przypadków trisomii 21 spośród całkowitej liczby 42 przebadanych próbek.¹⁹ W tej samej publikacji badacze donoszą o próbach optymalizacji ilościowej oceny sekwencji swoistych dla trisomii 21 za pomocą nowych algorytmów obliczania wartości z tzw. z score.

Wspomniane prace dostarczają dowodów na możliwość skutecznej diagnostyki trisomii 21 u płodu opartej na analizie pozakomórkowego DNA z zastosowaniem modelu progu ilościowego. W przypadkach trisomii 13 i 18 zastosowanie technologii równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA daje wskaźniki wykrywalności poniżej 100%, ale wciąż są one bardzo duże.

Celowane sekwencjonowanie DNA

Część zespołów w celu wykrywania trisomii u płodu stosuje inną technikę: celowane sekwencjonowanie DNA (targeted DNA sequencing). W tej metodzie analizie ilościowej poddawane są jedynie sekwencje swoiste dla badanych chromosomów – na przykład chromosomów pary 21, 13 i 18 – w przeciwieństwie do wyżej opisanej techniki, w której sekwencjonowana jest cała pozyskiwana pula DNA pozakomórkowego zawierająca DNA ze wszystkich chromosomów matki i płodu. Wybrane fragmenty DNA można sekwencjonować, wykorzystując odpowiednie sondy.

Jeden z zespołów (Ariosa; San Jose, Kalifornia) w kolejnych publikacjach przedstawia zachęcające wyniki, które opiera albo na 99% prawdopodobieństwie (progu) wystąpienia trisomii 21, albo przeciwnie – mniejszym niż 1% prawdopodobieństwie, że płód jest prawidłowy.⁵ Ariosa szacuje wartość ryzyka nie tylko na podstawie ilościowej oceny liczby sekwencji swoistych dla danego chromosomu, ale także biorąc pod uwagę wiek matki i odsetek DNA pozakomórkowego pochodzenia płodowego. Zaawansowany wiek matki z większym prawdopodobieństwem będzie wiązał się z wynikiem prawdziwie dodatnim niż z fałszywie dodatnim (tzn. czułość wzrasta z częstością występowania). Podobnie dokładność oceny ilościowej zależy od ilości DNA płodowego dostępnego badaniu.

Wstępne doniesienia wskazywały na 100% wykrywalność w próbkach z ciąż dotkniętych trisomią 21.⁴ Następnie Norton i wsp. opublikowali wyniki badania kohortowego obejmującego grupę kobiet (średnia wieku 34,3 roku) poddawanych w większości przypadków diagnostyce w II trymestrze ciąży (średni wiek ciążowy 17 tygodni).⁹ Nie uzyskano wyniku w 4,6% przypadków (1,8% niewystarczająca ilość DNA; 2,8% niepowodzenie metody). Wykryto wszystkie z 81 przypadków trisomii 21 oraz 37 z 38 trisomii 18. Odnotowano jeden przypadek wyniku fałszywie dodatniego (0,3%).

W jednym z ostatnich doniesień dotyczących opisywanej metody przedstawiono wyniki rutynowego badania przesiewowego kobiet w pierwszym trymestrze ciąży, o średniej wieku 31,8 roku.¹⁰ Przypadki, w których nie uzyskano wyniku, stanowiły ponownie około 5%. Wykryto wszystkie z 8 przypadków trisomii 21 oraz 2 z 3 trisomii 18 (biorąc pod uwagę względnie młody wiek matek oczekiwano niewielkiej liczby przypadków trisomii). Wyniki fałszywie dodatnie stanowiły 0,1%.

Inny zespół pracujący w Stanach Zjednoczonych, wykorzystujący technikę celowanego sekwencjonowania (Natera; San Carlos, Kalifornia), rozpoznanie opiera na rodzicielskim polimorfizmie pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphisms, SNP),³¹ technice, której przydatność udowodniono wcześniej w przedimplantacyjnej diagnostyce genetycznej.²⁰ Znajomość SNP rodziców pozwala określić wszystkie potencjalne genotypy płodu obejmujące trisomie, disomie i monosomie. Stosując statystykę bayesowską można określić wartości predykcyjne dla indywidualnych przypadków.

Wykorzystując tę metodę, Zimmerman i wsp. przebadali 166 próbek, analizując 11 000 SNP na chromosomach 13, 18, 21, X i Y.¹¹ W przebadanej puli wykryto: 2 przypadki trisomii 13, 3 trisomii 18, 11 trisomii 21, 2 monosomii 45,X oraz 2 zespołu Klinefeltera (47,XXY). We wszystkich przypadkach potwierdzono prawidłowo zdiagnozowaną liczbę chromosomów.

Potencjalną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania na mniejszej ilości pozakomórkowego DNA płodu. We wstępnych doniesieniach odsetek przypadków, w których nie zdołano uzyskać wyniku, wynosił 12,6, chociaż kryterium określenia badania jako przydatnego diagnostycznie było, w przeciwieństwie do innych badań, uzyskanie danych na temat wszystkich 5 chromosomów. Jeśli wziąć pod uwagę tylko 3 trisomie autosomalne (13, 18, 21), wówczas odsetek badań, w których nie uzyskano wyniku, jest porównywalny do innych doniesień.

Wnioski dla lekarza położnika

Obecnie można stwierdzić, że badanie pozakomórkowego DNA płodu cechuje wysoka skuteczność wykrywania trisomii 21: 99 lub 100%. Nieco mniejsza, ale wciąż satysfakcjonująca, jest skuteczność wykrywania trisomii 13 i 18. W porównaniu z modelowym obecnie badaniem przesiewowym w kierunku aneuploidii wykorzystującym ocenę stężenia PAPP-A i hCG we krwi matki w połączeniu z badaniem przezierności karku (nuchal translucency, NT) wydaje się, że badanie pozakomórkowego DNA płodu jest metodą lepszą. Wskaźnik wyników fałszywie dodatnich jest mniejszy niż 1%, a więc dużo mniejszy od 5% wyników fałszywie dodatnich cechujących badanie surowicy krwi matki w połączeniu z NT. Ponadto uważa się, że badanie pozakomórkowego DNA płodu w celu wykrywania aneuploidii jest bezpieczniejsze, ponieważ wymaga mniejszej liczby inwazyjnych procedur.

Zanim badanie to znajdzie ogólne zastosowanie, należałoby opracować technikę badania w czasie rzeczywistym, co oznaczałoby, że próbki krwi są na bieżąco analizowane w laboratorium, a wyniki badania dostępne w odpowiednio krótkim czasie. Na razie nie wiadomo, czy tak prowadzone badania potwierdzą 99% wskaźnik wykrywalności trisomii 21, jaki obserwowano w badaniu próbek ocenianych zbiorczo w trybie retrospektywnym, i czy uda się utrzymać niespełna 1% wskaźnik wyników fałszywie dodatnich.

Według badań walidacyjnych oraz badań wykorzystujących zdeponowane wcześniej próbki analiza pozakomórkowego DNA płodu w celu skrinigu aneuploidii, w porównaniu z dotychczas stosowanymi metodami wykrywania trisomii 21, wydaje się jednak bliska ideału. Pomiar przezierności karku prawdopodobnie pozostanie w użyciu w celu wykrywania istotnego poszerzenia (>3 lub >4 mm), co będzie wskazywało na obecność wady serca lub będzie wskazaniem do biopsji kosmówki w celu analizy chromosomów bez dalszych badań przesiewowych. Wydaje się, że badanie markerów aneuploidii we krwi matki zostanie jednak wycofane z pierwotnego skriningu aneuploidii u płodu.

Wyniki fałszywie dodatnie najprawdopodobniej mają jakieś uzasadnienie biologiczne i są tym samym niemożliwe do całkowitego wyeliminowania. Potencjalne wytłumaczenie ich uzyskiwania może stanowić zjawisko „znikającego aneuploidalnego bliźniaka”, ograniczony do łożyska mozaicyzm lub mozaicyzm komórek somatycznych u matki. W takich przypadkach w celu potwierdzenia rozpoznania konieczna jest biopsja kosmówki lub amniopunkcja. Badanie pozakomórkowego płodowego DNA pozostanie zatem badaniem przesiewowym, a nie diagnostycznym, w wyniku którego podejmowane są decyzje dotyczące dalszego postępowania. Badanie weryfikujące w postaci biopsji kosmówki czy amniopunkcji wykaże prawidłowy kariotyp (zatem wynik fałszywie dodatni) dużo rzadziej, niż wykazałoby w przypadku weryfikowania nieprawidłowego wyniku badania markerów aneuploidii w surowicy krwi ciężarnej w połączeniu z oceną NT.

Wyniki nieprzydatne diagnostycznie

Co najmniej 5% analizowanych próbek nie przynosi przydatnych diagnostycznie wyników. Jednym z powodów jest niewystarczająca ilość pozakomórkowego DNA płodu, stanowiąca określony procent całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki. Oczywistym rozwiązaniem mogłoby być powtórzenie badania po tygodniu, jednak okazuje się, że niekoniecznie przyniosłoby to lepsze rezultaty, gdyż ilość pozakomórkowego DNA płodu między 10 a 21 tygodniem nie zwiększa się wraz z wiekiem ciąży. Innym możliwym wytłumaczeniem jest zawodność metody. Problemy dotyczące kontroli jakości mogą zmniejszać się wraz z rosnącym doświadczeniem, ale z kolei to ostatnie może wiązać się z kłopotami wynikającymi z coraz większej liczby analizowanych próbek.

Obecnie badanie może być zaproponowane dopiero po 10 tygodniu ciąży, ponieważ wcześniej ilość DNA może być niewystarczająca. W odniesieniu do wczesnej diagnozy interesujące są ostatnie doniesienia o poprawnej diagnostyce mukowiscydozy i rdzeniowego zaniku mięśni w 63 przypadkach, w których przeprowadzono analizę komórek płodowego trofoblastu uzyskanych z krwi matek w pierwszym trymestrze ciąży, u których jednocześnie wykonywano biopsję kosmówki ze względu na objawy kliniczne. Procedura ta (Rarecells Diagnostics; Paryż) obejmuje analizę molekularną pojedynczych komórek trofoblastu, które izolowano przy użyciu filtra, począwszy od 5 tygodnia ciąży.²¹

Koszty

Wyzwaniem dla szerszego zastosowania analizy pozakomórkowego DNA w celach diagnostyki prenatalnej są koszty. Jeden ze sprzedawców oszacował cenę badania wykorzystującego metodę równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA na około 2700 dolarów, biorąc pod uwagę wkład indywidualnych ubezpieczycieli. Idealnie koszty powinny być porównywalne do badania markerów w surowicy matki, chociaż nie muszą być one dokładnie takie same, jeśli założy się, że niespełna 1% wskaźnik wyników fałszywie dodatnich przyniesie oszczędności w wyniku mniejszej liczby wykonywanych procedur inwazyjnych.