BLACK CYBER WEEK! Publikacje i multimedia nawet do 80% taniej i darmowa dostawa od 350 zł! Sprawdź >
Czy jesteśmy na to gotowi?
Załóżmy, że żaden z opisanych powyżej problemów nie okaże się poważną przeszkodą dla wprowadzenia metody do codziennego stosowania. Czy oznacza to, że środowisko położników i ginekologów powinno zmienić standardy postępowania dotyczące prenatalnych badań przesiewowych w kierunku aneuploidii i wprowadzić powszechnie analizę pozakomórkowego DNA płodu? Bądź co bądź, wskaźniki wykrywalności aneuploidii w tej metodzie wydają się o 10-15% wyższe od 85-90% wskaźnika wykrywalności charakterystycznego dla testu PAPP-A w połączeniu z oceną NT. Poza tym, podobnie jak w przypadku obecnego statusu diagnostyki wykorzystującej pozakomórkowe DNA płodu, także w przypadku oceny markerów w surowicy ciężarnej wstępne badania przed wprowadzaniem do praktyki klinicznej przeprowadzano jedynie na zdeponowanych wcześniej próbkach; duże badania kohortowe pojawiły się później.
Czy analiza pozakomórkowego DNA płodu powinna być proponowana jako jedyne badanie przesiewowe? Moim zdaniem powinna, ale niewątpliwie pojawią się propozycje połączenia jej z wybranymi elementami funkcjonujących programów przesiewowych wykorzystujących analizę markerów w surowicy krwi matki. Nie jest to jednak konieczne, a z pewnością mało praktyczne.
Skrining aneuploidii oparty na analizie pozakomórkowego DNA płodu powinien być procedurą na tyle skuteczną, aby nie wymagał przeprowadzania wcześniejszych badań. Dodatni wynik badania przesiewowego powinien wiązać się z bezpośrednim skierowaniem pacjentki na badanie inwazyjne, bez dodatkowych konsultacji. Pomiar NT w badaniu ultrasonograficznym powinien pozostać w użyciu ze względu na jego przydatność w wykrywaniu wad serca niezwiązanych z obecnością trisomii. Konieczne jest także kontynuowanie badań mających na celu wykrywanie wad cewy nerwowej – albo w badaniu ultrasonograficznym w drugim trymestrze, albo na podstawie oceny stężenia α-fetoproteiny w surowicy matki.
Czy pacjenci zaakceptują badanie pozakomórkowego DNA płodu jako badanie przesiewowe w kierunku aneuploidii u płodu? Oczywiście. Mały wskaźnik wyników fałszywie dodatnich sam w sobie jest atutem. Już teraz obserwujemy pacjentów zainteresowanych minimalizowaniem ryzyka wystąpienia wyniku fałszywie dodatniego i jego konsekwencji. Takie sytuacje są niepożądane, wiążą się z dużym stresem u pary i wymagają zastosowania procedury inwazyjnej. Pacjenci oczekują także wyższych wskaźników wykrywalności chorób u płodu.
W Wielkiej Brytanii nieinwazyjna diagnostyka prenatalna wykorzystująca pozakomórkowe DNA płodu jest szeroko stosowana u pacjentów z grupy dużego ryzyka wystąpienia chorób genetycznych sprzężonych z płcią. Z najnowszego doniesienia z tego kraju wynika, że pacjenci akceptują tę metodę, jednak konsultacja specjalisty jest równie ważna przed, jak i po badaniu.
Jest jeszcze jedno zastrzeżenie dotyczące analizy pozakomórkowego DNA płodu: są nim ograniczenia diagnostyczne metody stosowanej w obecnej postaci. Obecnie nie ma możliwości wykorzystania pozakomórkowego DNA płodu w nowej metodzie określanej jako porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy (array comparative genome hybridization, aCGH). Technika ta daje możliwość identyfikacji nie tylko wszystkich aneuploidii, ale także mikrodelecji i mikroduplikacji, które są zbyt małe, aby uwidocznić je w klasycznym badaniu kariotypu. Dlatego prenatalna aCGH wykonywana na pozakomórkowym DNA płodu miałaby daleko szersze zastosowanie niż proste wykrywanie trisomii 13, 18 i 21.
W ciążach dotkniętych wadami rozwojowym płodu, stwierdzonymi w badaniu ultrasonograficznym, zastosowanie metody aCGH pozwala wykryć dodatkowe 6% nieprawidłowości cytogenetycznych w stosunku do samego kariotypu, natomiast u ciężarnych w starszym wieku, bez nieprawidłowości płodu obserwowanych w USG, nawet 1,7% zaburzeń więcej w stosunku do klasycznego kariotypu.23 Teoretycznie przeprowadzenie aCGH na pozakomórkowym DNA płodu jest możliwe, chociaż obecnie wydaje się, że prenatalna aCGH będzie wymagać nienaruszonych komórek płodowych uzyskiwanych drogą biopsji kosmówki lub amniopunkcji, lub też komórek trofoblastu płodu wyizolowanych z krwi matki.21
Przyszłość badań chromosomowych u płodu
Wstępne doniesienia z lat 2011 i 2012 pozwalają z całą pewnością stwierdzić, że analiza pozakomórkowego DNA płodu jest skuteczną metodą wykrywania trisomii 21 u płodu. Wskaźnik wykrywalności obecnie sięga niemal 100%. Wskaźnik wyników fałszywie dodatnich nie przekracza 1% i jest dużo mniejszy niż 5% wskaźnik cechujący badanie I trymestru w postaci testu PAPP-A i ultrasonograficznego pomiaru NT. Oznacza to zmniejszenie liczby inwazyjnych procedur.
Jeżeli kolejne wyniki okażą się równie korzystne, będzie to przesłaniem, aby zalecić wykonywanie analizy pozakomórkowego DNA płodu jako badania pierwszego rzutu w skriningu aneuploidii. Pamiętając, że wstępne doniesienia na temat tej metody dotyczyły pacjentek z grupy dużego ryzyka, nieuniknione jest, że początkowo wytyczne będą sugerowały wykonywanie tego badania w takich populacjach pacjentek.
Nowe stanowisko American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) odzwierciedla dane z dotychczasowego piśmiennictwa.24 O tym, jakiego przyspieszenia nabrała ta dziedzina wiedzy, świadczy choćby to, że w stanowisku tym zabrakło odniesienia do jednego badania obejmującego populację małego ryzyka.10 Wydaje się, że w chwili pojawienia się większej liczby podobnych doniesień konieczne będzie jego uaktualnienie.
W grudniu 2012 roku Beijing Genetics Institute opublikował chińskie doświadczenia poparte zachęcającymi wynikami badań prowadzonych w ciągu 2 lat u 11 105 ciężarnych zarówno z grupy małego, jak i dużego ryzyka.25 Spośród 49 ośrodków w 7 pacjentki kwalifikowano do badania niezależnie od wyników wcześniejszej oceny ryzyka. Wykryto wszystkie 143 przypadki trisomii 21 oraz wszystkie 47 trisomii 18. Odnotowano jeden fałszywie dodatni wynik trisomii 21 oraz 1 fałszywie dodatni wynik trisomii 18. Biorąc pod uwagę to doniesienie, które ukazało się już po publikacji stanowiska ACOG,24 istnieją silne przesłanki, aby ACOG rozszerzyło w swych wytycznych zastosowanie badania na całą populację ciężarnych.
Jak przyczajona w tle postać z obrazu Magritte’a, na swoją kolej czeka prenatalna aCGH. Metoda ta ma szanse istotnie zwiększyć liczbę wykrywanych zaburzeń, nie tylko trisomii. Czy wskazane jest zatem w dalszym ciągu poszukiwanie tylko trisomii u płodu w sytuacji, kiedy dzięki aCGH można wykryć znacznie więcej? Jaki koszt jesteśmy w stanie ponieść, aby uniknąć inwazyjnych procedur diagnostycznych? Czy wykrywanie większej liczby zaburzeń metodą aCGH (lub sekwencjonowania całego genomu płodu) przebije nieinwazyjną analizę pozakomórkowego DNA płodu, przyczyniając się tym samym do zwiększenia liczby badań inwazyjnych? Czy metoda analizy pozakomórkowego DNA płodu jest w stanie rozwinąć się tak, aby dorównać skutecznością aCGH?
Z drugiej strony, jeżeli uda się opracować prostą metodę pozyskiwania nienaruszonych komórek trofoblastu z krwi ciężarnej, czy analiza tego materiału nie byłaby atrakcyjniejszą opcją niż badanie pozakomórkowego DNA płodu, które trzeba izolować z mieszaniny DNA pozakomórkowego matki? Jak widać, dziedzina badań prenatalnych z pewnością będzie się dalej rozwijać.
Kluczowe zagadnienia
• Zakładając, że płodowe DNA stanowi 5% pozakomórkowego DNA obecnego we krwi matki, w próbce pochodzącej od ciężarnej, której płód jest dotknięty trisomią 21, powinno się znajdować 2,5% więcej sekwencji charakterystycznych dla chromosomu 21 niż w przypadku zdrowego płodu.
• Analiza pozakomórkowego DNA płodu nie będzie badaniem diagnostycznym, którego wynik będzie decydował o dalszym postępowaniu; będzie ono miało charakter badania przesiewowego.
• Konsultacja specjalisty może być równie ważna przed, jak i po badaniu.
• Dotychczasowe prace dostarczają dowodów na możliwość skutecznej diagnostyki trisomii 21 u płodu na podstawie analizy pozakomórkowego DNA z zastosowaniem modelu progu ilościowego. W przypadkach trisomii 13 i 18 zastosowanie metody równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA daje wskaźniki wykrywalności poniżej 100%, ale wciąż są one bardzo wysokie.
• Czy pacjenci zaakceptują badanie pozakomórkowego DNA płodu jako badanie przesiewowe w kierunku aneuploidii u płodu? Oczywiście. Mały odsetek wyników fałszywie dodatnich sam w sobie jest tu atutem.
• Teoretycznie przeprowadzenie aCGH na pozakomórkowym DNA płodu jest możliwe, obecnie jednak wydaje się, że prenatalna aCGH będzie wymagać nienaruszonych komórek płodowych uzyskiwanych drogą biopsji kosmówki lub amniopunkcji, lub też komórek trofoblastu płodu wyizolowanych z krwi matki.
Contemporary OB/GYN, Vol. 58, No 1, p. 26. Nonivasive fetal diagnosis. Promise versus practicality.
Komentarz
Prof. dr hab. n. med. Grzegorz H. Bręborowicz
Katedra i Klinika Perinatologii i Ginekologii UM, Poznań
We współczesnej medycynie perinatalnej diagnostyka prenatalna stanowi bardzo istotny element oceny stanu płodu, prognozy co do dalszego jego rozwoju oraz jakości życia w przyszłości. Istnieją dwa kierunki tego typu badań – inwazyjne oraz nieinwazyjne. Chociaż w ostatnich latach nastąpił niezwykle dynamiczny rozwój badań nieinwazyjnych, należy je nadal traktować jako uzupełniające. Obecnie, ze względu na ich dostępność, najczęściej badane są określone markery biochemiczne w surowicy krwi matki, ocenia się też przezierność karku w badaniu ultrasonograficznym. Stosując różne kombinacje tych badań, wykonywanych w różnych okresach ciąży (test podwójny, potrójny…), uzyskano wysokie wskaźniki wykrywalności anomalii genetycznych u płodu, osiągające wartości 85-90%.
Artykuł dr Simpsona omawia obecne możliwości prenatalnej diagnostyki genetycznej opartej na analizie pozakomórkowego płodowego DNA. Możliwości jego izolacji z krwi matki zostały opisane ponad 15 lat temu przez zespół Lo. W tym czasie do diagnostyki wprowadzane były nowe techniki badań genetycznych, które pozwoliły na prawie 100% identyfikację zaburzeń chromosomowych. Wyniki tych badań są o kilka procent wyższe w porównaniu do dotychczas stosowanych metod biochemicznych połączonych z badaniem ultrasonograficznym. Istotne jest również to, że charakteryzują się one bardzo małym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich (poniżej 1%).
Postęp w diagnostyce prenatalnej wykorzystującej badania genetyczne jest niezwykle dynamiczny. Nowe, czasami przełomowe wyniki badań są publikowane w odstępach kilkumiesięcznych. Przykładem może być stanowisko American College of Obstetricians and Gynecologists przedstawione w opinii nr 515 opublikowanej w 2012 roku, które zaleca tego typu badania w populacji dużego ryzyka. W ciągu kilku miesięcy od pojawienia się tego dokumentu opublikowano prace (np. zespołu Nicolaidesa) wskazujące na wartość tego typu diagnostyki również w populacji małego ryzyka. Także w technikach badawczych obserwujemy bardzo szybki postęp. Autor artykułu opisuje takie badania, jak równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA czy celowane sekwencjowanie DNA, a w kilka miesięcy po ukazaniu się tego artykułu pojawia się publikacja Chena i wsp.,1 w której opisano nieinwazyjną sekwencyjną metodę oceny całego genomu płodu. Badania te są w pewnym sensie kontynuacją wcześniejszych badań przeprowadzonych przez zespół Kitzmanna.
Szczególną wartością komentowanej pracy jest dyskusja nad dalszymi kierunkami rozwoju diagnostyki prenatalnej. Autor, członek zespołu, który przed ponad 20 laty zajmował się wykrywaniem trisomii u płodu na podstawie analizy jego krwinek czerwonych izolowanych z ustroju matki, przedstawia w pracy metody, z którymi wiąże nadzieje dalszego postępu. Szczególną uwagę skupia na porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (array comparative genome hybridization, aCGH). Metoda ta pozwala na identyfikację mikrodelecji i mikroduplikacji. Chociaż teoretycznie można ją przeprowadzić na pozakomórkowym DNA, praktycznie korzystniejsza jest analiza całego materiału genetycznego z całych komórek płodowych. Pozyskiwanie takich komórek metodami nieinwazyjnymi otwiera nowy kierunek badań, ponieważ dotychczas pobierane one były w trakcie biopsji kosmówki, amniopunkcji lub kordocentezy. Alternatywą jest wychwytywanie komórek trofoblastu z krwi matki. W wielu ośrodkach na świecie prowadzone są w tym kierunku badania, których głównym celem jest uzyskanie maksymalnej liczby komórek płodu. Przykładem takich badań mogą być prace niemiecko-polskiego zespołu, który wykorzystując metody nanotechnologii, stworzył cewnik opłaszczony swoistymi przeciwciałami, umieszczany w naczyniu ciężarnej. Prace są zaawansowane i obecnie koncentrują się na uzyskaniu przeciwciała, które będzie się charakteryzowało największą swoistością w stosunku do komórek trofoblastu.2
Istotne jest to, że autor artykułu nie kwestionuje wartości dotychczasowych badań nieinwazyjnych stosowanych w diagnostyce prenatalnej, wskazując na stałą ich przydatność w diagnostyce niektórych wad układu krążenia (badanie przezierności karku) lub ośrodkowego układu nerwowego (α-fetoproteina).
W pełni uznając nowe technologie wprowadzane do diagnostyki prenatalnej, trzeba pamiętać o stale istniejących ograniczeniach związanych z ich wprowadzaniem. Dotyczy to ich kosztów, czasu oczekiwania na wynik, propagowania nowych technologii w środowisku medycznym oraz aspektów etycznych. Istnieją również ograniczenia diagnostyczne stosowanych dotychczas metod oceny pozakomórkowego DNA. Nie należy również oczekiwać, że stosując badania genetyczne, nasze końcowe rozpoznanie nie będzie obarczone pewnym, prawdopodobnie bardzo małym, błędem. Może on powstać w przypadku różnych postaci mozaicyzmu lub obumarcia jednego z płodów w ciąży wielopłodowej, nosiciela określonej anomalii.
Podsumowując, z pełnym przekonaniem należy stwierdzić, że obecnie widzimy jedynie pierwsze zwiastuny możliwości diagnostyki prenatalnej wykorzystującej technologie genetyczne. Ich szybki rozwój pozwala oczekiwać, że w najbliższych latach diagnostyka aneuploidii przy wykorzystaniu tych metod będzie badaniem rutynowym, które w wybranych sytuacjach będzie uzupełniane oceną pojedynczych mutacji.
Piśmiennictwo
1. Chen S, Ge H, Wang X, et al. Haplotype-assisted accurate noninvasive fetal whole genome recovery through maternal plasma sequencing. Genome Med. 2013;5(2):18.
2. Luecke K, Madejczyk M, Schniedermann J, et al. A novel approach for the in vivo isolation of fetal cells directly from the maternal circulation for prenatal diagnostics using a functionalized structured medical wire (FSMW). Arch Per Med. 2013;19(1):18-23.