Preimplantacyjne badania genetyczne (PGT – preimplantation genetic testing) są jednym z głównych osiągnięć technologii wspomaganego rozrodu (ART – assisted reproductive technologies) w ciągu ostatnich 45 lat. Cele PGT obejmują: zapobieganie transmisji patologicznych stanów uwarunkowanych genetycznie, poprawę wyników zapłodnienia in vitro (IVF – in vitro fertilization) oraz skrócenie czasu do zajścia w ciążę dzięki możliwości wyboru prawidłowego (euploidalnego) zarodka¹. Badania te polegają na pobraniu i zbadaniu komórek trofoektodermy, które uzyskuje się z rozwijającej blastocysty, typowo po 5-6 dniach od pobrania oocytu².

W zależności od celu badania pobrane komórki można poddawać różnym analizom. PGT mają kilka różnych zastosowań, w tym badania w kierunku:

• aneuploidii (PGT-A – preimplantation genetic testing for aneuploidy)
• chorób jednogenowych (PGT-M – preimplantation genetic testing for monogenic disease)
• rearanżacji strukturalnych (PGT-SR – preimplantation genetic testing for structural rearrangements).

Nowsze zastosowanie diagnostyki preimplantacyjnej, którego wartości wciąż nie udowodniono, polega na badaniach przesiewowych w kierunku chorób poligenicznych (PGT-P – preimplantation testing for polygenic disease). Istotą PGT-A jest ocena zarodków powstałych dzięki metodzie IVF w celu zbadania ich pod kątem kompletu chromosomów i ustalenia, które zarodki są chromosomalnie prawidłowe (euploidalne), a które nie (aneuploidalne). PGT-M wykonuje się w celu zmniejszenia ryzyka wystąpienia określonych chorób genetycznych u dziecka.

Podczas PGT-SR dokonuje się przesiewowej oceny w kierunku strukturalnych rearanżacji chromosomalnych, które zwykle mają charakter zrównoważonych translokacji lub inwersji, a badanie to wykonuje się najczęściej u par z wywiadami nawracających poronień. PGT-P można wykorzystywać do określenia potencjalnego ryzyka rozwoju chorób o późnym początku i dziedziczeniu poligenicznym, w tym: cukrzycy, chorób układu krążenia oraz niektórych nowotworów złośliwych. Preimplantacyjne badanie zgodności tkankowej zarodka (PGT-HLA – preimplantation genetic testing-human leukocyte antigen) wykorzystuje się do dobierania pod względem antygenów zgodności tkankowej w układzie HLA w celu zapewnienia zgodności płodu z potencjalnym biorcą, zwykle wymagającym przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych.

Historia PGT

W ostatnich latach znacznie zwiększyło się zastosowanie PGT, z mniej więcej 1000 cykli ART w połowie pierwszej dekady XXI wieku do nieco poniżej 19 000 cykli w 2014 roku, ponad 54 000 cykli w 2017 roku i obecnie blisko 40% cykli ART w Stanach Zjednoczonych³. Ogromną większość wykonywanych zabiegów stanowią PGT-A. PGT uległy kilku zmianom od czasu wprowadzenia tego rodzaju badań genetycznych. Początkowe próby PGT-A w latach 90. XX wieku podejmowane na zarodkach znajdujących się na etapie kilku komórek (dzień 3) były nieskuteczne z kilku przyczyn. Ze względu na wczesny mozaicyzm zarodka ograniczona liczba uzyskanych komórek często nie była reprezentatywna dla ostatecznej rzeczywistej linii komórkowej zarodka, a dostępna technologia – zwykle fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH – fluorescence in situ hybridization) – pozwalała na ocenę jedynie ograniczonej liczby (typowo 5-10) określonych nieprawidłowości chromosomalnych. W doniesieniach z tamtego okresu nie potwierdzono skuteczności PGT-A z użyciem metody FISH – wykazano dużą częstość błędów⁴. W rezultacie kilka towarzystw naukowych, w tym American Society for Reproductive Medicine (ASRM), nie zalecało PGT-A⁵.

Później wprowadzono kilka metod umożliwiających pełną przesiewową ocenę wszystkich 24 chromosomów, w tym: porównawczą hybrydyzację genomową do mikromacierzy (aCGH – array comparative genomic hybridization), ocenę polimorfizmów pojedynczych nukleotydów z użyciem mikromacierzy (SNPa – single nucleotide polymorphism arrays), ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR – quantitative polymerase chain reaction), a ostatnio sekwencjonowanie następnej generacji (NGS – next-generation sequencing). Zastosowanie tych metod na etapie blastocysty (dzień 5 lub 6) umożliwiło uzyskanie większej liczby komórek trofoektodermy, co zwiększyło dokładność diagnostyczną i zmniejszyło szkodliwość wpływu tego zabiegu na zarodek, ponieważ pobiera się relatywnie mniejszą część masy komórek na późniejszym etapie rozwoju zarodka^6,7. Kolejne postępy dotyczące hodowli komórek blastocysty, metod inkubacji, witryfikacji zarodków oraz metod molekularnych umożliwiających ocenę liczby kopii we wszystkich chromosomach spowodowały dalszą poprawę wskaźników uzyskiwanych ciąż i zmniejszenie częstości błędów². Obecnie stosowane metody, w tym qPCR i NGS, mają określone ograniczenia i zalety.

Potencjalna wartość PGT-A

Badanie genetyczne zarodków w kierunku aneuploidii ma kilka potencjalnych zalet podczas IVF. Jeżeli wykonuje się PGT-A, a następnie dokonuje transferu chromosomalnie prawidłowego zarodka, można zwiększyć odsetek implantacji zarodków i uzyskiwanych ciąż, co pozwoliło wielu ośrodkom IVF na zwiększenie częstości wykonywania planowego transferu pojedynczego zarodka i w ten sposób redukcję w zakresie występowania ciąż wielopłodowych. W rezultacie od 2014 roku nastąpiło istotne zmniejszenie częstości ciąż bliźniaczych i wyższego rzędu, podczas gdy w ciągu trzech poprzednich dekad częstość ta rosła z roku na rok⁷. U kobiet, które otrzymują euploidalny zarodek, obserwuje się również poprawę ogólnych wyników ciąży i zmniejszenie częstości występowania poronień, zwłaszcza w przypadku bardziej zaawansowanego wieku matki⁸. Wykazano również, że u kobiet z nawracającymi poronieniami następuje skrócenie czasu do zajścia w ciążę w porównaniu z postępowaniem wyczekującym.

Komu należy oferować PGT?

Pełna przesiewowa ocena chromosomów za pomocą którejś z nowszych metod umożliwiła wykrywanie aneuploidii w ramach PGT-A, co przynosi korzyści w grupach ryzyka⁹. PGT-M należy oferować parom planującym rozród, u których w rodzinie występuje dziedziczna choroba na podłożu znanej lub dającej się wykryć nieprawidłowości genetycznej. Wykonywanie PGT-SR jest potencjalnie przydatne u osób ze znanymi rearanżacjami chromosomów rodzicielskich, takimi jak translokacja wzajemna, a zwłaszcza u par z nawracającymi poronieniami w wywiadach, pod warunkiem że od kobiety można pozyskać odpowiednią liczbę euploidalnych oocytów⁹.

PGT-A

Częstość występowania nieprawidłowości chromosomalnych zwiększa się wraz z wiekiem matki i stwierdza się je w ponad 30% klinicznie rozpoznanych ciąż u kobiet w wieku powyżej 40 lat¹⁰. W tej populacji korzyścią wynikającą z wykonania PGT-A jest umożliwienie oceny występowania aneuploidii w nadziei wyboru euploidalnego (chromosomalnie prawidłowego) zarodka do transferu¹. Korzyści z PGT-A mogą odnosić kobiety w wieku 35 lat lub starsze, a także pacjentki z wywiadami niepowodzenia implantacji lub nawracającego poronienia. Wybór i transfer euploidalnego zarodka zwiększa szansę implantacji i uzyskania ciąży¹¹.

Aneuploidia jest ważną przyczyną niepowodzeń cykli IVF i poronień, a częstość jej występowania – jak wspomniano wcześniej – zależy od wieku matki. Kiedy kobieta osiągnie 42 lata, częstość występowania aneuploidii u zarodków wzrasta do mniej więcej 80%¹². W badaniu, w którym oceniano częstość wykrywania aneuploidii u zarodków ocenianych metodami PGT-A, stwierdzono wzrost częstości występowania aneuploidii wraz z wiekiem matki – odsetek ten wyniósł: 46% u kobiet poniżej 35 roku życia, 54% u kobiet w wieku 35-37 lat, 63% u kobiet w wieku 38-40 lat, 66% u kobiet w wieku 41-42 lat oraz 54% u kobiet, które skończyły 42 lata¹³.

Mimo że PGT-A wydaje się atrakcyjną strategią diagnostyczną, to w dużej, wieloośrodkowej randomizowanej, kontrolowanej próbie klinicznej z udziałem kobiet w wieku 25-40 lat, u których do przesiewowej oceny wykorzystano platformę NGS, nie potwierdzono, aby zastosowanie tej metody zwiększyło częstość uzyskiwania utrzymujących się ciąż¹⁴. W analizie post hoc wykazano istotny wzrost częstości udanych ciąż tylko w kohorcie w wieku 35-40 lat. Wyboru zarodków tradycyjnie dokonuje się na podstawie oceny opartej na kryteriach morfologicznych, ale nie pozwala ona dokładnie przewidywać statusu chromosomalnego zarodków i ma pewne swoiste ograniczenia¹⁵. Obecnie stwierdza się istotne różnice między poszczególnymi ośrodkami ART pod względem klinicznych wyników stosowania PGT-A, co znajduje odzwierciedlenie w rozbieżnych publikowanych wynikach, więc nie uzgodniono jednolitego stanowiska w kwestii optymalnego przedziału wiekowego dla wykonywania PGT-A w kontekście formułowania zaleceń dotyczących praktyki klinicznej.

Ograniczenia PGT

Preimplantacyjne badania genetyczne nie są pozbawione ryzyka. Wszystkie rodzaje PGT opierają się na inwazyjnym zabiegu wykonywanym na rozwijającej się blastocyście, polegającym na chirurgicznej aspiracji komórek trofoektodermy (typowo 5-7 komórek) do dalszych analiz. Fakt, że po późniejszym przeniesieniu euploidalnego zarodka w ponad 30% przypadków nie udaje się uzyskać ciąży, a także istotna zmienność częstości powodzenia ciąż między różnymi laboratoriami wykonującymi PGT silnie przemawiają za potencjalną szkodliwością tego zabiegu.

Oprócz niejasności w kwestii tego, kto jest optymalnym kandydatem do PGT-A, dodatkowe problemy stwarza interpretacja wyniku. Istnieje możliwość mozaicyzmu zarodka z obecnością więcej niż jednej chromosomalnie odmiennej linii komórkowej w zarodku, w tym co najmniej jednej nieprawidłowej linii komórkowej, ale w przypadku utrzymujących się naturalnych ciąż dotyczy to tylko 1-2% zarodków¹⁶. Prawdziwy mozaicyzm wiąże się z większym ryzykiem niepowodzenia implantacji oraz poronienia. Znacznie większą częstość występowania mozaicyzmu obserwowano w przypadku PGT-A, zwłaszcza jeżeli stosuje się platformę NGS¹⁷. Opisywano wiele przypadków uzyskania ciąży i urodzenia zdrowego potomstwa po transferze zarodków ze stwierdzonym mozaicyzmem, co wskazuje, że taki wynik PGT-A może być artefaktem laboratoryjnym, a nie wyrazem prawdziwego mozaicyzmu¹⁸. Wydaje się, że to zjawisko jest następstwem zmienności liczby kopii w analizowanych chromosomach, co może stwarzać pozorne wrażenie mozaicyzmu, kiedy liczba kopii wykracza poza granice ustalone w algorytmie interpretacyjnym.