Dodatkowym czynnikiem zaburzającym ocenę może być to, że komórki typowo uzyskiwane z zewnętrznej warstwy trofoektodermy zarodka mogą nie być reprezentatywne dla wewnętrznej masy komórek zarodka, czyli okolicy, z której ostatecznie rozwija się płód. Zmienność podawanej częstości występowania mozaicyzmu może wynikać z: nierównego rozkładu takich komórek w obrębie zarodka, artefaktów testowania, błędów amplifikacji, zanieczyszczeń, zmienności techniki biopsji, a także z różnic w warunkach laboratoryjnych19. Kwestia, co robić z tymi tzw. mozaikowymi zarodkami, pozostaje nierozwiązanym problemem ośrodków ART i ich pacjentów, którzy zmagają się z decyzjami, czy takie zarodki przenosić, wyrzucać czy też czekać na bardziej rozstrzygające wskazówki20,21.

PGT-M

Według ASRM preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku chorób jednogenowych ujawniających się w wieku dorosłym są etycznie dopuszczalne w przypadku różnych stanów, zwłaszcza kiedy dane schorzenie jest poważne i nie ma bezpiecznych oraz skutecznych metod interwencji22. PGT-M było pierwszym zastosowaniem PGT w 1989 roku, a obecnie można w ten sposób przesiewowo oceniać zarodki w kierunku ponad 1000 bardzo różnych dziedzicznych stanów i chorób, takich jak: mukowiscydoza, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, choroba Huntingtona, rdzeniowy zanik mięśni oraz nosicielstwo genów BRCA. Metodę tę można teoretycznie stosować w przypadku każdej choroby jednogenowej, w której jednoznacznie zidentyfikowano locus wywołujące chorobę. Zwykle takie badania są wykonywane po wystąpieniu choroby u dziecka osoby badanej lub jej bliskiego krewnego, ale coraz częściej pary chcą poddać się PGT-M po tym, jak oboje partnerów okazało się nosicielami genu choroby, kiedy przeprowadzono prenatalne badania przesiewowe z użyciem rozszerzonego panelu testów nosicielstwa, często przed planowaną ciążą. Wiele par woli wybrać zarodek bez genów choroby lub będący co najwyżej jej nosicielem, niż później polegać na inwazyjnej diagnostyce prenatalnej czy ryzykować wystąpienie choroby u dziecka.

W diagnostyce prowadzonej w ramach PGT-M nastąpił znaczny postęp od czasu wprowadzenia w latach 90. XX wieku pierwotnej technologii amplifikacji metodą PCR. Choroby jednogenowe, których warianty genetyczne są znane, mogą być przesiewowo wykrywane w ramach PGT-M poprzez celowaną amplifikację danego obszaru genomu, a następnie minisekwencjonowanie lub genotypowanie namnożonego produktu metodą qPCR, co pozwala znaleźć dany wariant genetyczny. Alternatywnie można do tego wykorzystywać kariomapowanie z użyciem mikromacierzy zawierających do 300 000 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) znajdujących się w obszarach rozrzuconych po całym genomie. Obecnie PGT-M wykonuje się zwykle metodą SNPa. Mikromacierz zawiera potencjalnie kilka milionów sond, czyli krótkich odcinków DNA, które umożliwiają przesiewową ocenę genotypu w zakresie setek tysięcy wybranych SNP ze wszystkich chromosomów podczas jednej reakcji. Jest to znacznie bardziej wydajne, ekonomiczne i dokładne rozwiązanie. PGT-M charakteryzuje się bardzo małą częstością błędów.

PGT-SR

Oszacowana częstość występowania zrównoważonych strukturalnych rearanżacji chromosomalnych wynosi mniej niż 1% w populacji ogólnej oraz około 6% u par z nawracającym poronieniem w wywiadach, ale stan ten może mieć katastrofalne konsekwencje dla potencjału reprodukcyjnego dotkniętych nim osób23. Ryzyko niepłodności, poronień, urodzeń martwych oraz urodzenia dziecka z nieprawidłowością chromosomalną różni się znacznie w zależności od charakteru wykrytej rearanżacji strukturalnej (translokacja wzajemna lub robertsonowska, inwersja lub złożona rearanżacja chromosomalna). Przed zaplanowaniem PGT-SR niezbędne jest poradnictwo genetyczne. Obecnie PGT-ST wykonuje się typowo metodą aCGH, NGS lub SNPa.

Koszt PGT

Wiarygodność i efektywność kosztowa PGT-M oraz PGT-SR zostały dobrze ustalone. PGT-A jest efektywną kosztowo strategią diagnostyczną w przypadku zaawansowanego wieku matki, zwiększa wówczas prawdopodobieństwo powodzenia ciąży i zmniejsza ryzyko poronienia13. Stwierdzono, że po identyfikacji euploidalnego zarodka szanse na zajście w ciążę u kobiet w wieku powyżej 40 lat są takie jak u kobiet w wieku poniżej 30 lat. Dodatkowe korzyści postulowane w przypadku IVF z wykorzystaniem PGT-A w porównaniu z IVF bez takiej oceny obejmują: obniżenie łącznych kosztów w przeliczeniu na jedno żywe urodzenie, skrócenie czasu leczenia, redukcję liczby nieudanych transferów zarodka oraz zmniejszenie częstości występowania klinicznych poronień13. Wartość takiej diagnostyki u kobiet w wieku poniżej 30 lat nie została udowodniona. W przeszłości wykonywanie PGT zwiększało koszt cyklu IVF o 1000-4000 dol. w zależności od ośrodka ART, charakteru wykonywanych badań oraz liczby ocenianych zarodków. Nowsze technologie umożliwiające badanie wielu próbek z użyciem jednej mikromacierzy pozwalają jednak na istotne obniżenie tych kosztów.

Przyszłość

Preimplantacyjne badania genetyczne i związane z nimi technologie umożliwiły w krótkim czasie znacznie większy wgląd w skład genetyczny rozwijającego się zarodka, co potencjalnie pozwala na eliminację wielu nieuleczalnych chorób i poprawę ogólnej skuteczności zabiegów IVF. Każdy postęp, rozwiązujący określony problem diagnostyczny lub interpretacyjny, stwarza jednak nowe wyzwania, a nasze rozumienie zalet i ograniczeń poszczególnych metod wciąż ewoluuje. Można oczekiwać dalszego doskonalenia już stosowanych technologii, a ponadto opracowywane są też nowsze, nieinwazyjne metody wyboru zarodków, takie jak zastosowanie obliczeń metodami sztucznej inteligencji w połączeniu z mikroskopią poklatkową w celu określenia optymalnych markerów rozwoju zarodka, a także analiza pozakomórkowego DNA uwalnianego przez rosnący zarodek do zużytego podłoża hodowlanego24.

Piśmiennictwo

1. Sciorio R, Tramontano L, Catt J. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) and genetic testing for aneuploidy (PGT-A): status and future challenges. Gynecol Endocrinol 2020;36(1):6-11. doi: 10.1080/09513590.2019.1641194

2. Capalbo A, Rienzi L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertil Steril 2017;107(5):1098-106. doi: 10.1016/j.fertnstert.2017.03.023

3. Roche K, Racowsky C, Harper J. Utilization of preimplantation genetic testing in the USA. J Assist Reprod Genet 2021;38(5):1045-53. doi: 10.1007/s10815-021-02078-4

4. Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med 2007;357(1):9-17. doi: 10.1056/NEJMoa067744

5. Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology; Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Preimplantation genetic testing: a Practice Committee opinion. Fertil Steril 2007;88(6):1497-504. doi: 10.1016/j.fertnstert.2007.10.010

6. Scott RT Jr, Upham KM, Forman EJ, et al. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril 2013;100(3):624-30. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.04.039

7. Martin JA, Osterman MJK. NCHS Data Brief No. 351. US Department of Health and Human Services. October 2019. https://www.cdc.gov/nchs/data/databriefs/db351-h.pdf. Dostęp 10.01.2023

8. Sacchi L, Albani E, Cesana A, et al. Preimplantation genetic testing for aneuploidy improves clinical, gestational and neonatal outcomes in advanced maternal age patients without compromising cumulative live-birth rate. J Assist Reprod Genet 2019;36(12):2493-504. doi: 10.1007/s10815-019-01609-4

9. Schoolcraft WB, Fragouli E, Stevens J, et al. Clinical application of comprehensive chromosomal screening at the blastocyst stage. Fertil Steril 2010;94(5):1700-6. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2009.10.015

10. Niu W, Wang L, Xu J, et al. Improved clinical outcomes of preimplantation genetic testing for aneuploidy using MALBAC-NGS compared with MDA-SNP array. BMC Pregnancy Childbirth  2020;20(1):388. doi: 10.1186/s12884-020-03082-9

11. Hassold T, Hunt P. Maternal age and chromosomally abnormal pregnancies: what we know and what we wish we knew. Curr Opin Pediatr 2009;21(6):703-8. doi: 10.1097/MOP.0b013e328332c6ab

12. Harton GL, Munné S, Surrey M, et al. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization.  Fertil Steril 2013;100(6):1695-703. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.2002

13. Neal SA, Morin SJ, Franasiak JM, et al. Preimplantation genetic testing for aneuploidy is cost-effective, shortens treatment time and reduces the risk of failed embryo transfer and clinical miscarriage. Fertil Steril 2018;110(5):896-904. doi: 10.1016/j.fertnstert.2018.06.021

14. Munné S, Kaplan B, Frattarelli JL, et al. Preimplantation genetic testing for aneuploidy versus morphology as selection criteria for single frozen-thawed embryo transfer in good-prognosis patients: a multicenter randomized clinical trial. Fertil Steril 2019;112(6):1071-9. doi: 10.1016/j.fertnstert.2019.07.1346

15. Capalbo A, Rienzi L, Cimadomo D, et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Hum Reprod 2014;29(6):1173-81. doi: 10.1093/humrep/deu033

16. Levy B, Hoffmann ER, McCoy RC, et al. Chromosomal mosaicism: origins and clinical implications in preimplantation and prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2021;41(5):631-41. doi: 10.1002/pd.5931

17. Treff NR, Marin D. The “mosaic” embryo: misconceptions and misinterpretations in preimplantation genetic testing for aneuploidy. Fertil Steril 2021;116(5):1205-11. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2021.06.027

18. Capalbo A, Poli M, Rienzi L, et al. A prospective double-blinded non-selection trial of reproductive outcomes and chromosomal normalcy of newborns derived from putative low/ moderate-degree mosaic IVF embryos. medRxiv. Published online February 8, 2021. doi: 10.1101/2021.02.07.21251201

19. Greco E, Litwicka K, Minasi MG, et al. Preimplantation genetic testing: where we are today. Int J Mol Sci 2020;21(12):4381. doi: 10.3390/ijms21124381

20. ACOG Committee Opinion No. 799: Preimplantation genetic testing. Obstet Gynecol 2020;135(3):e133-7. doi: 10.1097/AOG.0000000000003714

21. Practice Committee and Genetic Counseling Professional Group of the American Society for Reproductive Medicine. Clinical management of mosaic results from preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) of blastocysts: a committee opinion. Fertil Steril 2020;114(2):246-54. doi: 10.1016/j.fertnstert.2020.05.014

22. American Society for Reproductive Medicine. Use of preimplantation genetic testing for monogenic defects (PGT-M) for adult-onset conditions: an Ethics Committee opinion. Fertil Steril 2018;109(6):989-92. doi: 10.1016/j.fertnstert.2018.04.003

23. Ogur C, Kahraman S, Griffin DK, et al. Preimplantation genetic testing for structural rearrangements (PGT-SR) in 300 couples reveals individual specific risk factors but an inter chromosomal effect (ICE) is unlikely. Reproductive BioMedicine Online. Published online July 31, 2022. doi: 10.1016/j.rbmo.2022.07.016

24. Zmuidinaite R, Sharara FI, Iles RK. Current advancements in noninvasive profiling of the embryo culture media secretome. Int J Mol Sci 2021;22(5):2513. doi: 10.3390/ijms22052513

Komentarz

dr n. med. Monika Łukasiewicz

Przychodnia Lekarska nOvum w Warszawie

Fundacja Dla Kobiet w Warszawie

Small %c5%81ukasiewicz monika opt

dr n. med. Monika Łukasiewicz

Korzyści wynikające z zastosowania preimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku chorób jednogenowych (PGT-M) i rearanżacji strukturalnych (PGT-SR) są oczywiste i raczej rzadko kwestionowane. Pozwalają bowiem na uniknięcie monogenowych wad u potomstwa i niezrównoważonych translokacji chromosomalnych powodujących poronienia. Metody te tylko czasami wzbudzają obawy etyczne. W przypadku wad nieletalnych zarzuca się promowanie „dzieci projektowanych” oraz stosowanie potencjalnych praktyk eugenicznych, w wyniku których tylko doskonałe zarodki są wybierane do implantacji. Skuteczność PGT w kierunku aneuploidii (PGT-A) ciągle jest jednak przedmiotem kontrowersji i dzieli świat naukowy na zwolenników i przeciwników.

Diagnostyka preimplantacyjna w kierunku aneuploidii wydaje się według niektórych idealnym narzędziem badania zarodków. Sprawdza się szczególnie u kobiet po 40 roku życia, kiedy płodność dramatycznie się obniża, wzrasta liczba aneuploidii w zarodkach oraz liczba poronień. Transfer jednej euploidalnej blastocysty wydaje się zatem rozwiązaniem teoretycznie poprawiającym statystykę urodzenia zdrowego dziecka, skracającym czas zajścia w ciążę i zmniejszającym liczbę poronień1. Kahraman i wsp. w swoim retrospektywnym badaniu, w którym przeanalizowali 2064 cykle zapłodnienia in vitro (IVF), wykazali, że w grupie pacjentek, u których zastosowano PGT-A, prawdopodobieństwo ciąży i żywych urodzeń było istotnie statystycznie większe niż w grupie kobiet, u których nie przeprowadzono PGT-A. Stwierdzili również, że w pierwszej grupie ryzyko poronienia było dwukrotnie mniejsze2. I teoretycznie można by zakończyć w tym momencie dyskusję, gdyż w większości klinik oferuje się parom PGT-A, często jednak niezależnie od wieku pacjentki, jej rokowania i rezerwy jajnikowej. Zaczęłam z ciekawości śledzić w bazie PubMed dyskusję dotyczącą tego badania. Świat naukowy lekko zawrzał. Po ponownej analizie statystycznej głównego punktu końcowego, jakim było take-home live baby, Orvieto i wsp. wykazali, że w 218 cyklach po wykonaniu PGT-A embriony zostały odrzucone mimo ich potencjału do implantacji i ciąży3. Robert Casper stwierdził, że gdyby pacjentki z badania Kahramana nie wykonały PGT-A, skutkowałoby to 223 żywymi urodzeniami więcej. Tymczasem okazuje się, że w Stanach Zjednoczonych PGT-A wykonuje się w przypadku 50% cykli, w Wielkiej Brytanii w 8-9%, podczas gdy w Holandii w 0% cykli i traktuje się PGT-A jako metodę, w której brakuje wystarczającej ilości dowodów naukowych, żeby zalecać ją pacjentkom jako standard.

Wróćmy do statystyki. W 2023 roku na łamach „Journal of Assisted Reproduction and Genetics” Kucherov i wsp. opublikowali dane, z których wynika, że zastosowanie PGT-A w porównaniu z cyklami, w których nie wykonano PGT-A, zmniejsza kumulatywny odsetek żywych urodzeń (CLBR – cumulative live birth rate). Badanie oparto na analizie 133 943 cykli, a wyżej wspomnianą korelację zauważono w każdej grupie wiekowej, oprócz pacjentek powyżej 40 roku życia. Badanie pokazuje, że zostało odrzuconych i zniszczonych wiele zarodków, które uznano za nieprawidłowe, a które mogłyby dać prawidłową ciążę4. Barad i wsp. posunęli się jeszcze dalej i postanowili przetransferować zarodki przebadane w kierunku aneuploidii w innych klinikach i odrzucone z powodu nieprawidłowych wyników PGT-A. W tym badaniu warto zwrócić uwagę na średni wiek pacjentek, który wynosił 41 lat (±4 lata). Wykonano transfery 144 zarodków (proszę pamiętać, że wszystkie zostały odrzucone w poprzednich klinikach). Wśród tych zarodków u 72% stwierdzono 1-2 nieprawidłowości chromosomalne, u 21,3% wykazano obecność ≥3 aberracji chromosomalnych, a 6,4% zarodków odrzucono z powodu braku technicznej możliwości wykonania diagnostyki zarodka. Na uwagę zasługuje wynik tego badania: transfer nieprawidłowych zarodków w PGT-A zaowocował bowiem 8 zdrowymi ciążami5.

W kontekście publikowanych obecnie badań dotyczących PGT-A i fali krytyki tej metody warto zwrócić uwagę na kilka nie do końca jasnych i często rzadko branych pod uwagę szczegółów:

  • mozaikowatość zarodków – PGT-A wiążą się często z mozaikowatością zarodków. Wykazano, że z takich zarodków urodziło się ponad 100 zdrowych dzieci (2019 rok). W badaniach wykazano, że pewien rodzaj mozaikowatości rokuje lepiej niż inne. W rozmowie z pacjentami powinno się uwzględnić zatem odsetek mozaikowatości w zarodku, chromosomy (który chromosom, czy mamy do czynienia z monosomią czy trisomią, czy zaburzenie dotyczy całego chromosomu czy jego części). Często zarodki z mozaikowatością nie są transferowane. Prowadzi to do odrzucania potencjalnie zdolnych do przeżycia zarodków, co skutkuje utratą szans na udane ciąże. Może mieć to duże znaczenie w przypadku pacjentek po 40 roku życia i kobiet z małą rezerwą jajnikową, dla których taki zarodek może być jedyną szansą na własną ciążę
  • mechanizm samonaprawiania się zarodków – w badaniach na zwierzętach wykazano, że nieprawidłowe zarodki mają tendencję do samonaprawiania się. W trakcie podziałów odrzucają nieprawidłowe komórki, a podziałowi ulegają tylko komórki prawidłowe. Orvieto i wsp. udowodnili, że dokładnie tak samo zachowują się zarodki ludzkie. W badaniu wykazano, że w przypadku 5 euploidalnych blastocyst (badaniu poddano 9 euploidalnych blastocyst) fragmenty, które zostały odrzucone przez blastocystę, były aneuploidalne3. Wykazana możliwość samonaprawiania się zarodka może budzić wątpliwości, czy w przypadku PGT-A i wyników fałszywie dodatnich nie odrzucamy prawidłowych zarodków
  • wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne – zarówno mozaicyzm zarodków, jak i możliwość samonaprawiania się mogą prowadzić do postawienia błędnej diagnozy i skutkować odrzuceniem zdrowych zarodków, a także do transferów zarodków nieprawidłowych. Istnieją też inne czynniki, które istotnie mogą zaburzyć wynik badania, takie jak: artefakty testu, nieprawidłowa amplifikacja, zabrudzenie próbki, nieprawidłowe mitozy, błędy techniczne popełniane w trakcie biopsji, warunki w laboratorium embriologicznym
  • wpływ psychologiczny – technika PGT-A może być emocjonalnie trudna dla par, ponieważ wywiera na nie ogromną presję, aby podjąć decyzje dotyczące losu ich zarodków. Potencjał fałszywych wyników i niepewność dotycząca dokładności PGT-A mogą wywoływać znaczny stres i przyczyniać się do zbyt wczesnej rezygnacji z procedury
  • wyższe koszty – PGT-A to kosztowne badanie, dodatkowo obciążające finansowo pary, które podchodzą do procedury IVF. Koszt wielu cykli PGT-A może być nie do udźwignięcia dla niejednej pary, a przez to może ograniczać dostęp do tej technologii i potencjalnie pogłębiać istniejącą już frustrację
  • ograniczone testowanie genetyczne – technika PGT-A skupia się głównie na ocenie zarodków pod kątem aneuploidii, czyli obecności nieprawidłowej liczby chromosomów. Nie zapewnia jednak kompleksowego testowania genetycznego w kierunku innych zaburzeń genetycznych, co ogranicza jej skuteczność w identyfikowaniu innych potencjalnych zagrożeń zdrowotnych
  • inwazyjność procedury – PGT-A wymaga pobrania kilku komórek z zarodka do analizy genetycznej. Ta inwazyjna procedura niesie ze sobą niewielkie ryzyko uszkodzenia zarodka, co może zagrażać jego zdolności do przeżycia i zmniejszać szansę na udaną ciążę.

Diagnostykę preimplantacyjną i badanie blastocyst w kierunku aneuploidii należy traktować jako procedurę zindywidualizowaną. Rozmowa z pacjentami powinna być prowadzona rzetelnie i na podstawie faktów medycznych. PGT-A nie powinno być rutynowym badaniem proponowanym każdej parze bez względu na wiek i stężenie hormonu antymüllerowskiego (AMH – anti-Müllerian hormone). European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) w 2020 roku określiło zasady dobrej praktyki lekarskiej dotyczące PGT, które nas – lekarzy zajmujących się leczeniem par dotkniętych niepłodnością – powinny obowiązywać. Według rekomendacji ESHRE PGT-A można zaproponować pacjentom w następujących sytuacjach:

  • zaawansowany wiek matki (AMA – advanced female/ maternal age)
  • nawracający brak implantacji (RIF – recurrent implantation failure)
  • nawracające poronienia (RM – recurrent miscarriage)
  • poważny czynnik męski (SMF – severe male factor).

Kontrowersje wokół PGT-A sprawiają, że świat nauki ciągle szuka nowych rozwiązań w diagnostyce preimplantacyjnej. Na uwagę zasługują badania typu non-invasive PGT-A (niPGT-A) albo minimally invasive PGT-A (miPGT-A). Odpowiedzi na pytanie, jaki jest materiał genetyczny zarodka, szuka się w wolnym DNA (cfDNA – cell-free DNA) izolowanym z mediów do hodowli zarodków. Metoda ta wydaje się zarówno mniej inwazyjna dla zarodka, jak i dużo mniej kosztowna, ale wymaga przeprowadzenia większej liczby badań. Ciągle jednak pozostają kwestie mozaicyzmu i wyników fałszywie dodatnich, które powodują odrzucanie zarodków mogących potencjalnie dać prawidłową ciążę.


Piśmiennictwo

1. Practice Committee and Genetic Counseling Professional Group (GCPG) of the American Society for Reproductive Medicine. Clinical management of mosaic results from preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) of blastocysts: a committee opinion. Fertil Steril 2020;114(2):246-54. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2020.05.014

2. Kahraman S, Duzguner INB, Sahin Y, et al. What to advise to patients with only one good quality blastocyst, PGT-A or not? Outcomes of 2064 cycles. J Assist Reprod Genet 2022;39(11):2555-62. doi: 10.1007/s10815-022-02617-7

3. Orvieto R, Shimon C, Rienstein S, et al. Do human embryos have the ability of self-correction? Reprod Biol Endocrinol 2020;18(1):98. doi: 10.1186/s12958-020-00650-8

4. Kucherov A, Fazzari M, Lieman H, et al. PGT-A is associated with reduced cumulative live birth rate in first reported IVF stimulation cycles age ≤40: an analysis of 133,494 autologous cycles reported to SART CORS. J Assist Reprod Genet 2023;40(1):137-49. doi: 10.1007/s10815-022-02667-x

5. Barad DH, Albertini DF, Molinari E, et al. IVF outcomes of embryos with abnormal PGT-A biopsy previously refused transfer: a prospective cohort study. Hum Reprod 2022;37(6):1194-206. doi: 10.1093/humrep/deac063

Do góry