Najczęstszą aberracją chromosomową w NIHF jest monosomia X (ryc. 4), ale obrzęk może występować również u płodów z innymi aberracjami, np. trisomią 21, 18 i 13 (ryc. 5), a także triploidią^11-13. Standardowe badanie genetyczne stosowane w diagnostyce prenatalnej, czyli porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy (aCGH – array comparative genomic hybridization), pozwala na identyfikację aberracji chromosomowych, takich jak trisomie i monosomia X, delecje czy duplikacje, nie wykrywa jednak triploidii, której wykluczenie wymaga wykorzystania innych metod genetycznych.

Aberracje chromosomowe możliwe do wykrycia za pomocą aCGH są najczęstszą przyczyną obrzęku płodu w I trymestrze ciąży^1,12. W przypadku obrzęku rozwijającego się na późniejszym etapie ciąży diagnostyka może wymagać bardziej zaawansowanych narzędzi, takich jak sekwencjonowanie eksomowe (ES), a nawet sekwencjonowanie genomowe (GS), które zostaną omówione w dalszej części opracowania. NIHF może bowiem występować w różnych zespołach związanych z patogennymi wariantami w specyficznych genach, których wykrycie nie jest możliwe przy użyciu klasycznego badania cytogenetycznego lub aCGH (w tzw. chorobach monogenowych)¹⁴.

Znanych jest ponad 80 jednostek chorobowych dziedziczonych monogenowo, które mogą się wiązać z występowaniem NIHF, a do najczęściej opisywanych w literaturze należą tzw. RASopatie^11,12. Są to rzadkie, dziedziczne schorzenia spowodowane patogennymi wariantami w genach kodujących białka szlaku sygnalizacyjnego RAS/MAPK prowadzącymi do jego nadmiernej aktywacji. Szlak RAS/MAPK odgrywa kluczową rolę w regulacji proliferacji, różnicowania, dojrzewania i apoptozy komórek, a jego zaburzenia skutkują nieprawidłowym rozwojem tkanek i narządów, a także zwiększonym ryzykiem nowotworów. Jednym z najczęściej występujących zaburzeń w tej grupie jest zespół Noonan, którego cechami charakterystycznymi są: niski wzrost, dysmorfia twarzy, wady serca i opóźnienie rozwoju. W okresie prenatalnym u płodów z tym zespołem często obserwuje się zwiększoną przezierność karkową (NT – nuchal translucency) w I trymestrze ciąży, a w II trymestrze – wodniaka karku, obrzęk tkanki podskórnej oraz obecność hydrothorax. Diagnostyka genetyczna w kierunku zespołu Noonan obejmuje analizę takich genów, jak: PTPN11, SOS1, KRAS, RAF1, BRAF, MEK1/2 oraz NF1, choć patogenne warianty mogą występować również w innych genach^11,15.

Dysplazje kostne obejmują ponad 400 różnych jednostek chorobowych. Patogenne warianty genetyczne prowadzą do objawowych zaburzeń formowania układu szkieletowego, a zmienna penetracja i ekspresja poszczególnych wariantów odpowiada za zróżnicowane nasilenie objawów. Niektóre choroby kości diagnozowane są dopiero po urodzeniu, jednak część dysplazji, w tym dysplazja tanatoforyczna, dysplazja kampomeliczna czy osteogenesis imperfecta, charakteryzuje się ciężkim lub letalnym przebiegiem. Zespoły te są często związane z defektami strukturalnymi i hemodynamicznymi, które mogą przyczyniać się do obrzęku, szczególnie w połączeniu z wadami serca lub układu limfatycznego¹⁶. Mutacje w genach, takich jak FLT4, który jest związany z wrodzonymi wadami układu chłonnego, mogą prowadzić do uogólnionego obrzęku płodu wynikającego z niewydolności drenażu limfatycznego. Ponadto mutacje w genach odpowiedzialnych za rozwój układu sercowo-naczyniowego, takich jak NKX2-5 czy MYH7, mogą prowadzić do wad wrodzonych serca i wtórnego obrzęku płodu.

Choroby metaboliczne stanowią grupę rzadkich zaburzeń, w których patogenne warianty genetyczne prowadzą na poziomie komórkowym do dysfunkcji enzymatycznych lub zaburzeń w procesach metabolicznych. Do najczęściej opisywanych w piśmiennictwie należą: wrodzone defekty metabolizmu glikogenu, wrodzone zaburzenia glikozylacji białek (CDG – congenital disorders of glycosylation) oraz zaburzenia w metabolizmie lipidów i lizosomalne choroby spichrzeniowe, takie jak choroba Niemanna-Picka typu C czy choroba Gauchera. W tych przypadkach obrzęk płodu jest często skutkiem uogólnionej dysfunkcji narządowej prowadzącej do upośledzenia funkcji wątroby, serca lub układu limfatycznego¹⁷. Przed wprowadzeniem zaawansowanych metod genetyki molekularnej diagnostyka chorób metabolicznych opierała się na badaniu aktywności wybranych enzymów w płynie owodniowym. Ze względu na celowany charakter badania i konieczność pozyskania znacznej objętości płynu owodniowego metoda ta miała jednak ograniczone znaczenie w okresie prenatalnym. Obecnie prowadzone są badania nad zastosowaniem terapii enzymatycznej w leczeniu chorób lizosomalnych już w okresie prenatalnym. Dr Tippi MacKenzie i jej zespół z University of California w San Francisco prowadzą przełomowe badania w zakresie chorób metabolicznych, takich jak lizosomalne choroby spichrzeniowe. Badacze w szczególności koncentrują się na wewnątrzmacicznym podawaniu enzymów zastępczych (IUERT – in utero enzyme replacement therapy), co ma na celu zapobiegnięcie uszkodzeniom ośrodkowego układu nerwowego na etapie niedojrzałej bariery krew–mózg. Wyniki wstępnych badań klinicznych (NCT04532047) wskazują, że IUERT może być skutecznym narzędziem w prewencji nieodwracalnych uszkodzeń narządów i rozwoju odpowiedzi immunologicznej na białka terapeutyczne¹⁸.

Ustalenie genetycznego podłoża NIHF ma kluczowe znaczenie dla poradnictwa genetycznego, pozwala na lepsze oszacowanie ryzyka nawrotu oraz planowanie postępowania w przyszłych ciążach^11,14,19. Choroby monogenowe dziedziczone autosomalnie recesywnie wiążą się z wysokim ryzykiem powtórzenia w kolejnej ciąży, które wynosi 25%. Ustalenie nosicielstwa chorób dziedziczonych autosomalnie recesywnie umożliwia diagnostykę preimplantacyjną w przypadku zastosowania metod wspomaganego rozrodu bądź celowaną diagnostykę prenatalną z materiału pozyskanego na drodze biopsji kosmówki, co zwiększa szanse na urodzenie zdrowego dziecka. Ze względu na możliwość mozaikowatości ograniczonej do gonad NIHF może pojawić się w kolejnej ciąży również w przypadku chorób dziedziczonych autosomalnie dominująco. Zidentyfikowanie podłoża genetycznego NIHF ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patomechanizmu obrzęku i może otworzyć drogę do specyficznych terapii enzymatycznych w okresie pre- i postnatalnym.

Nowoczesne metody diagnostyki molekularnej

Sekwencjonowanie eksomowe to zaawansowana technika genetyczna umożliwiająca analizę wszystkich sekwencji kodujących białka w celu identyfikacji wariantów o potencjalnym charakterze patogennym²⁰. Metoda ta znajduje szczególne zastosowanie w diagnostyce chorób monogenowych, które nie są możliwe do wykrycia z pomocą klasycznych metod cytogenetycznych, takich jak prążkowa analiza kariotypu czy kariotyp molekularny z użyciem mikromacierzy (aCGH).

Od kilku lat ES zyskuje coraz większe znaczenie w diagnostyce prenatalnej NIHF. Częstość wykrywania patogennych wariantów genetycznych w różnych populacjach jest zróżnicowana i zależy od obecności towarzyszących wad strukturalnych^21-26. Przykładowo w badaniu Lord i wsp. odsetek zidentyfikowanych patogennych wariantów wynosił 9%²³, podczas gdy w badaniu HYDROPS osiągnął nawet 50%²⁴. W badaniu przeprowadzonym przez Deng i wsp. w grupie 109 płodów z NIHF w podgrupie 21 przypadków z prawidłowym wynikiem aCGH zidentyfikowano 3 patogenne warianty (14,3%) oraz 2 warianty o nieznanej patogenności (VUS – variants of uncertain significance), co stanowiło dodatkową wartość diagnostyczną². Z kolei Sparks i wsp. w swoim prospektywnym badaniu wykazali, że zastosowanie ES pozwala na postawienie diagnozy genetycznej w 29% przypadków²⁵.

Na podstawie metaanalizy Mone i wsp. potwierdzili, że ES przynosi dodatkową wartość diagnostyczną w 39% przypadków płodów z NIHF i towarzyszącymi wadami strukturalnymi²⁶. Te dane jednoznacznie podkreślają znaczenie ES jako niezastąpionego narzędzia w kompleksowej ocenie etiologii NIHF. W innym badaniu, przeprowadzonym przez Liu i wsp., przeanalizowano 53 przypadki niewyjaśnionego NIHF, w tym 39 płodów spełniało ścisłą definicję NIHF, a 14 charakteryzowało się jedynie podwyższoną NT i/lub obecnością wodniaka karku. Patogenne warianty genetyczne zidentyfikowano w 23% przypadków (12 z 53), a potencjalnie patogenne w dodatkowych 13% (7 z 53). Co istotne, w 3 przypadkach (7%) diagnozę postawiono dopiero po ponownej analizie danych. Najwyższy odsetek wykrytych wariantów patogennych i potencjalnie patogennych (43%) odnotowano w grupie płodów z obrzękiem skóry oraz z podwyższoną NT lub wodniakiem karku. W tej grupie liczącej 14 płodów rozpoznanie ustalono w 6 przypadkach. Natomiast w klasycznych przypadkach NIHF częstość wykrycia patogennych wariantów wynosiła 15% (6 z 39). W badaniu tym wskazano również na wpływ zastosowania ES na podejmowane decyzje kliniczne, gdyż odsetek terminacji ciąży w grupie z wykrytymi patogennymi wariantami genetycznymi był znacząco wyższy niż w grupie z prawidłowym wynikiem ES (92% vs 54%), a odsetek żywych urodzeń w tych grupach wynosił odpowiednio 8% i 37%²⁷.

W ramach badań własnych prowadzonych we współpracy z Zakładem Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie przeanalizowano grupę 10 płodów z rozpoznanym NIHF oraz prawidłowym wynikiem aCGH. Średni wiek ciąży w momencie wykrycia obrzęku wynosił 18 tygodni. U 8 z 10 płodów (80%) zaobserwowano dodatkowe wady strukturalne, co wskazuje na częste współwystępowanie anomalii morfologicznych u płodów z NIHF. Najczęściej stwierdzano: wady kośćca (n = 3), wady twarzoczaszki (n = 3) oraz wady ośrodkowego układu nerwowego (n = 3). Nieprawidłowy wynik badania genetycznego uzyskano u 6 płodów (60%; wariant patogenny n = 3, wariant potencjalnie patogenny n = 3), w tym u 3 płodów wykryte warianty genetyczne odpowiadały fenotypowi zespołu Noonan. U pozostałych 4 płodów zidentyfikowano warianty o nieznanej patogenności (VUS), które wymagają dalszej interpretacji i potencjalnego powiązania z obrazem klinicznym²⁸ (ryc. 6).

Istnieje kilka wyzwań związanych z interpretacją wyników ES^19,20. Choroby o dziedziczeniu jednogenowym mogą charakteryzować się zmienną ekspresją i penetracją, co oznacza, że ta sama mutacja genetyczna może prowadzić do różnych fenotypów klinicznych. Dodatkowo baza danych genetycznych jest ciągle uaktualniana, w związku z czym warianty genetyczne, które obecnie są klasyfikowane jako te o nieznanej patogenności (VOUS – variants of unknown significance), w przyszłości mogą zostać uznane za patogenne na podstawie nowych doniesień naukowych. Ograniczona liczba badań dotyczących prenatalnego wykorzystania ES utrudnia pełne zrozumienie związku między określonymi wariantami genetycznymi a fenotypem NIHF. Rozwój genetyki molekularnej i coraz większa dostępność baz danych wariantów genetycznych pozwalają na bardziej precyzyjną diagnostykę, która z czasem stanie się rutynową częścią diagnostyki prenatalnej¹⁹.

Wprowadzenie ES do diagnostyki NIHF znacząco zwiększyło wykrywalność podłoża genetycznego. ES obejmuje jednak jedynie sekwencje kodujące białka, które stanowią zaledwie 1,5-2% całego genomu. Z tego względu diagnostyka oparta wyłącznie na ES może pomijać potencjalnie istotne zmiany genetyczne zlokalizowane w sekwencjach niekodujących.

Sekwencjonowanie genomowe umożliwia szczegółową analizę całego genomu, w tym sekwencji niekodujących. Metoda ta pozwala na wykrycie nie tylko mutacji punktowych, lecz także aberracji strukturalnych, takich jak: insercje, delecje czy zrównoważone translokacje, które mogą być trudne do zidentyfikowania za pomocą aCGH. Ponadto GS pozwala na detekcję sekwencji powtórzonych, które potencjalnie mogą leżeć u podstaw NIHF, a których analiza jest poza zasięgiem ES czy aCGH.

Dotychczas zastosowanie GS w diagnostyce NIHF zostało opisane w jednym opublikowanym badaniu. Westenius i wsp. oceniali przydatność GS w grupie 23 płodów z NIHF, u których wcześniejsze badania aCGH nie wykazały nieprawidłowości. GS umożliwiło wykrycie nieprawidłowych wariantów genetycznych w 12 przypadkach (53%)²⁹. Warto jednak zauważyć, że analiza w tym badaniu była ograniczona do panelu 281 genów związanych z NIHF, co sugeruje, że pełne wykorzystanie potencjału GS mogłoby dostarczyć jeszcze bardziej szczegółowych danych diagnostycznych. Podczas badań własnych finansowanych z Narodowego Centrum Nauki w ramach grantu naukowego MINIATURA 7 w Klinice Ginekologii i Ginekologii Onkologicznej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie przeprowadzono GS u 14 płodów z NIHF o niewyjaśnionej przyczynie. Dotychczas poddano analizie wyniki uzyskane u 7 płodów. U 4 płodów stwierdzono znane patogenne warianty w genach FLNB, PIEZO1 (znany intronowy wariant), CBL, PTPN11, natomiast u 2 płodów wytypowano warianty, które mogą zostać powiązane z obserwowanym fenotypem (IFT122 [intronowy wariant nieobecny dotychczas w bazach], ALPK3, SYNE1). U jednego płodu z wodniakiem karku i nawracającym płynem w opłucnej nie udało się uzyskać żadnych wariantów możliwych do powiązania z zaobserwowanymi objawami klinicznymi (ciąża zakończyła się żywym urodzeniem w 37 tygodniu ciąży). Wyniki GS u pozostałych 7 płodów są w trakcie analizy (dane nieopublikowane) (ryc. 7).