Z kolei do tej pory nie potwierdzono hipotezy o znaczeniu prognostycznym mutacji dotyczących pojedynczego allela genu CEBPA (grupa IR-I wg zaleceń ELN).[19] Wydaje się zatem, że aberracje CEBPA obydwu alleli mogą dostarczać dwóch uderzeń jednocześnie potrzebnych do rozwoju pełnoobjawowej OBSz: aktywacji proliferacji oraz blokady różnicowania, w zależności od tego, w której części genu CEBPA doszło do mutacji – w domenie N- lub C-terminalnej. Dysfunkcja genu CEBPA u części chorych spowodowana jest wyciszeniem ekspresji z powodu hipermetylacji regionu promotorowego tego genu. Wyciszenie ekspresji CEBPA, podobnie jak mutacje obu alleli, jest markerem korzystnego rokowania.[20]

Molekularne markery niekorzystnego rokowania w grupie NK OBSz

Badania wykazują, iż znaczenie ma nie tylko sama obecność mutacji, ale również stosunek ilościowy allela z mutacją do allela prawidłowego, czyli tzw. allela dzikiego. Szczególnie niekorzystne rokowanie wykazują chorzy z przewagą allela zmutowanego.[21] Pomiaru stosunku allela zmutowanego do dzikiego dokonuje się metodą analizy fragmentów i ostatnie rekomendacje zalecają klasyfikację chorych, u których stosunek alella zmutowanego do dzikiego wynosi powyżej 0,5 – do grupy o zdecydowanie niekorzystnym rokowaniu, czyli IR-II.[17] U chorych z grupy NK OBSz stwierdza się również punktową mutację w genie FLT3, zmieniającą aminokwas w pozycji 835 (mutacja D835). Znaczenie rokownicze tej mutacji nie zostało jednoznacznie określone, najprawdopodobniej zależy ono od obecności dodatkowych mutacji.[22]

Innym markerem niekorzystnego rokowania jest częściowa, tandemowa duplikacja w genie MLL (MLL-PTD; partial tandem duplication), występująca u ok. 10 proc. chorych z NK OBSz. Mutacja ta często występuje u chorych FLT3-ITD pozytywnych (33 proc.). Chorych z MLL-PTD wg ostatnich zaleceń ELN klasyfikuje się do grupy IR-II.[16]

Dodatkowymi markerami prognostycznymi w NK OBSz są zaburzenia ekspresji, które dotyczą genów: ERG, BAALC, EVI1 oraz MN1. Zmiany w ekspresji polegają na patologicznej zmianie jej poziomu w porównaniu ze zdrowymi komórkami progenitorowymi linii mieloidalnej, co wiąże się z gorszym rokowaniem w wybranych podgrupach genetycznych chorych z NK OBSz. Np. ekspresja ERG wnosi dodatkową informację na temat rokowania chorego w grupie chorych NK OBSz, z wyjątkiem chorych wysokiego ryzyka FLT3-ITD(+)/NPM1 (-).[23,24] Natomiast znaczenie rokownicze nadekspresji genu BAALC odnotowano w grupie pacjentów bez jednoczesnej mutacji CEBPA oraz duplikacji FLT3[25], podczas gdy inne badania wykazały, że ocena ekspresji tego genu w kontekście występowania duplikacji FLT3 wnosi największą wartość prognostyczną.[26] Natomiast badania Langer i wsp.[27] wykazały, że ekspresja MN1 jest niezależnym czynnikiem prognostycznym dla całej grupy NK OBSz, w szczególności dla przypadków bez jednoczesnej mutacji NPM1 oraz FLT3-ITD.[28] U chorych o prawidłowym kariotypie niekorzystnie rokują też zaburzenia ekspresji cząsteczek mikroRNA, przykładowo wysoka ekspresja miR-155[29] oraz miR-196b i miR-644.[30]

Mutacje genów odpowiedzialnych za metylację/demetylację DNA

Badania ostatnich lat wykazały, że obok dwóch klasycznych form uderzeń – mutacji w obrębie genów aktywujących proliferację oraz blokujących dojrzewanie – w OBSz dochodzi również do mutacji w obrębie genów regulujących procesy epigenetyczne genomu. Wyodrębniono bowiem grupę genów, których produkty białkowe pośrednio lub bezpośrednio uczestniczą w procesach metylacji/demetylacji DNA.

Mutacje w obrębie tych genów diagnozuje się również w grupie chorych z NK OBSz. Są to geny: DNMT3A, TET2 oraz IDH1/2.[31] Mutacje genu kodującego metylotransferazę DNMT3A powodują zahamowanie aktywności tego enzymu i w konsekwencji zahamowanie metylacji DNA de novo. Mutacje TET2 natomiast powodują zaburzenie odwrotnego procesu, czyli demetylacji DNA. Z kolei mutacje w genie IDH1 lub IDH2 pośrednio zaburzają demetylację DNA, ponieważ zmutowane enzymy przekształcają α-ketoglutaran w 2-hydroksyglutaran, a to przekształcenie hamuje enzymy z rodziny TET. Bez α-ketoglutaranu enzymy TET nie działają prawidłowo, ponieważ związek ten jest ich niezbędnym kofaktorem. Badania wykazują, iż mutacje genu DNMT3A są markerem rokowania niekorzystnego, podobnie jak mutacje genu TET2, natomiast aberracja IDH2 R140 wydaje się być markerem rokowania korzystnego, chociaż istnieją rozbieżności wśród autorów prac.[32] Są bowiem badania wskazujące, że wykrycie mutacji TET2 wyodrębnia podgrupę chorych z niekorzystnym rokowaniem jedynie w grupie pacjentów z ustalonym korzystnym rokowaniem wg rekomendacji ELN, podczas gdy badanie tych mutacji nie ma znaczenia prognostycznego w grupie np. IR-I.[33]

Mutacje białek odpowiedzialnych za nadawanie i podtrzymywanie prawidłowego wzoru metylacji DNA okazują się istotnym aspektem transformacji nowotworowej w OBSz. Z biologicznego punktu widzenia mutacje w tych białkach zmieniają w sposób radykalny profil ekspresji genów, pośrednio także tych aktywujących proliferację (klasa I) oraz blokujących dojrzewanie (klasa II), prowadząc do transformacji OBSz. Dlatego zaktualizowana wersja modelu transformacji białaczkowej wg Gillilanda[2] powinna obejmować również mutacje klasy III, występujące w tych białkach, których działanie w komórce polega na modulowaniu ekspresji innych genów (ryc. 1 B). Z uwagi na skomplikowaną metodykę oznaczeń mutacji genu TET2 (duży obszar genu, w którym mogą wystąpić mutacje), ich analiza nie jest rekomendowana jako rutynowe badanie molekularne u nowo diagnozowanych chorych z NK OBSz, ale badanie to jest wykonywane w celach naukowych w ramach dużych prospektywnych prób klinicznych, w celu ostatecznego doprecyzowania znaczenia prognostycznego mutacji TET2.

Markery predykcyjne w OBSz niezależne od cytogenetycznej grupy ryzyka

Markerami predykcyjnymi niezależnymi od cytogenetycznej grupy ryzyka, w której znajduje się chory na OBSz, mogą być polimorfizmy genów kodujących enzymy odpowiedzialne za metabolizm arabinozydu cytozyny (AraC), który jest podstawowym lekiem w terapii ostrych białaczek szpikowych. Enzymy metabolizujące AraC to kinaza deoksycytydyny (DCK), która wewnątrzkomórkowo aktywuje tę substancję oraz m.in. deaminaza cytydyny (CDA) i 5’-nukleotydaza, które hamują AraC. Badanie Falk i wsp.[34] wykazało, że u chorych z mutacją FLT3-ITD (zwłaszcza tych, którzy równocześnie mają mutację w genie NPM1) jednoczesne występowanie polimorfizmów rs2072671 i rs532545 genu CDA wiąże się z krótszym całkowitym czasem przeżycia (OS). Polimorfizm rs10883841 genu kodującego 5’-nukleotydazę również koreluje z krótszym OS, z tym że u chorych bez mutacji FLT3-ITD. Badanie to wskazuje, iż w procesie diagnostycznym i doborze terapii OBSz warto zwracać uwagę nie tylko na aberracje, które stanowią bezpośrednią przyczynę transformacji nowotworowej, ale również na stan genów odpowiedzialnych za metabolizm leków wykorzystywanych w terapii. Polimorfizmy genów kodujących enzymy metabolizujące AraC powodują bowiem różnice w aktywności syntetyzowanych enzymów, co jest przyczyną różnic w odpowiedzi na AraC.

Markerem predykcyjnym niezależnym od wyniku badania cytogenetycznego mogą być również zmiany w procesie przycinania, czyli tzw. splicingu, polegającym na wycinaniu intronów i łączeniu eksonów w dojrzały traskrypt mRNA, który stanowić będzie matrycę do syntezy białka. Adarria i wsp. wykonali badanie, w którym z użyciem technologii mikromacierzy zanalizowali splicing genów w komórkach pobranych od chorych na OBSz, w porównaniu z prawidłowymi komórkami CD34⁺ szpiku.[35]

Badanie to wykazało, iż w komórkach OBSz zaburzenia składania mRNA są zjawiskiem powszechnym, dotyczącym wielu genów, w tym zaangażowanych w najważniejsze życiowe procesy komórki, m.in. proliferację, apoptozę, ochronę przed transformacją nowotworową. Obserwacja o zmianach splicingowych w komórkach OBSz jest istotna z punktu widzenia diagnostyki i terapii, ponieważ z jednej strony zmiany te mogą mieć znaczenie predykcyjne, z drugiej zaś nowo powstałe warianty transkryptów mogą stać się obiektem terapii celowanej.

Znaczenie wymienionych markerów w rutynowej diagnostyce jest obecnie znikome, głównie z uwagi na wysokie koszty badań. Badania te pozwalają jednak poznać biologiczne aspekty transformacji nowotworowej oraz ustalić kierunek prowadzenia w przyszłości prospektywnych badań oceniających znaczenie rokownicze nowych markerów molekularnych w OBSz.

Podsumowanie

• W ostatnich latach dokonano znacznego postępu w identyfikacji markerów molekularnych skorelowanych z rozwojem ostrych białaczek szpikowych. Postęp ten ma wymiar praktyczny, ponieważ umożliwia bardziej trafną ocenę ryzyka u poszczególnych chorych.
• W grupie chorych z białaczkami korzystnie rokującymi (CBF OBSz) identyfikacja dodatkowych mutacji pozwala potwierdzić, czy pacjenci ci rzeczywiście mają niskie ryzyko niepowodzenia terapii i wznowy choroby.
• W bardzo heterogennej grupie chorych o prawidłowym kariotypie identyfikacja markerów molekularnych o ustalonym znaczeniu prognostycznym daje dodatkową informację na temat odpowiedzi na terapię i ryzyka wznowy choroby.
• Badania nad panelem markerów molekularnych w OBSz są stale kontynuowane, czego dowodzą prace identyfikujące mutacje genów takich jak: DNMT3A, IDH1/2, TET2.
• Rekomendacje dotyczące standardów diagnostycznego postępowania u nowo diagnozowanych przypadków z NK OBSz zależą zarówno od rokowniczego znaczenia przedstawianych markerów, ale także technicznych możliwości laboratoriów oraz kosztów oznaczeń.[16]
• Niezależnie od pragmatycznego aspektu badań molekularnych, poznanie kolejnych markerów molekularnych i biologicznych mechanizmów odpowiedzialnych za transformację nowotworową w OBSz będzie miało istotne znaczenie również dlatego, że stwarza nadzieję na syntezę cząsteczek umożliwiających terapię celowaną, jak inhibitory zmutowanego receptora FLT3 lub cKIT.[1]