Nieinwazyjna diagnostyka płodu. Obietnice a praktyka

Możliwość analizy pozakomórkowego DNA płodu izolowanego z krwi matki oraz jej potencjalne zastosowanie zostały po raz pierwszy opisane 15 lat temu.¹ Praca Kitzmana i wsp., opublikowana w czerwcu 2012 roku, w której autorzy donoszą o nieinwazyjnym zsekwencjonowaniu całego genomu 18,5-tygodniowego płodu przy wykorzystaniu próbek krwi matki oraz śliny ojca, nadała tej technologii nowy wymiar, czyniąc z metody wykrywania aberracji chromosomowych czy chorób monogenowych diagnostykę prenatalną całego genomu płodu, uwzględniającą choroby dziedziczone recesywnie lub dominująco zgodnie z genetyką mendlowską.²

Badania przesiewowe i rzeczywiste wykrywanie trisomii na podstawie badania pozakomórkowego DNA płodu obecnego we krwi matki początkowo opierały się na analizach próbek pochodzących z ciąż, w których płód był dotknięty trisomią oraz ciąż, w których płód był zdrowy.^3-5

W 2011 i następnie w 2012 roku pojawiły się doniesienia o analizie próbek krwi matek, u których wykonywano jednocześnie tradycyjne badania inwazyjne w postaci biopsji kosmówki lub analizy płynu owodniowego uzyskanego podczas amniopunkcji.^6-11 Wyniki okazały się zachęcające. Wstępne doniesienia dotyczyły kobiet już zakwalifikowanych do biopsji kosmówki lub amniopunkcji (w ciążach dużego ryzyka), a próbki krwi pobierano przed wykonaniem procedury inwazyjnej. Ostatnio w podobnie przeprowadzonym badaniu odnotowano równie korzystne wyniki w grupie młodszych kobiet (średnia wieku 31,8 roku), która lepiej odzwierciedla ogólną populację ciężarnych (populacja małego ryzyka).¹⁰

Nie jest nadużyciem stwierdzenie, że nauka dotycząca prenatalnej diagnostyki genetycznej rozwija się w tempie, które jeszcze kilka lat temu było nie do wyobrażenia. Dla ginekologów położników wyzwaniem jest nie tyle śledzenie aktualnego piśmiennictwa technicznego, ile ocena przydatności nowych metod w opiece nad pacjentką oraz dowodów potwierdzających ich zastosowanie w klinice.

Wykrywanie trisomii 18 i 21: początki

Ponad 20 lat temu nasz zespół znalazł się wśród pionierów wykrywania trisomii u płodu metodą analizy jądrzastych krwinek czerwonych płodu izolowanych z krwi matki. Do analizy wykorzystywano technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) z zastosowaniem sond swoistych dla poszczególnych chromosomów.¹² Bianchi i wsp. w 1992 i Gänshirt-Ahlert i wsp. w 1993 roku potwierdzili wyniki uzyskane przez nasz zespół.^13,14

Po publikacji w 1993 roku szczegółowej pracy poświęconej aspektom technicznym metody wydawało się, że jej kliniczne zastosowanie jest nieuchronne.¹⁵ Niestety, okazało się, że pozyskiwanie komórek płodowych w celach diagnostycznych wymagało zastosowania metody izolowania komórek aktywowanych fluorescencją (fluorescence-activated cell sorting) lub magnetycznie (magnetic-activated cel sorting). Obie techniki są pracochłonne i mało powtarzalne. Mimo to w wieloośrodkowym badaniu sponsorowanym przez National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) poświęconym wykrywaniu trisomii 21 u płodów czułość metody wyniosła 74%.¹⁶

Pozakomórkowe DNA płodu

Zważywszy na trudności związane z pozyskiwaniem płodowych krwinek czerwonych i wprowadzeniem tej metody do praktyki klinicznej, uwaga naukowców została skierowana na pozakomórkowe DNA pochodzenia płodowego, które znajduje się w osoczu ciężarnych, zmieszane z pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego.¹ Wykrycie sekwencji DNA swoistych dla chromosomu Y we krwi matki potwierdziło pochodzenie materiału genetycznego od płodu płci męskiej, dzięki czemu udowodniono zasadność i skuteczność zastosowania tej metody.

We wspomnianym wcześniej badaniu NICHD¹⁶ wykrycie sekwencji swoistych dla chromosomu Y było warunkiem sine qua non potwierdzenia obecności nienaruszonych komórek pochodzenia płodowego (płodów płci męskiej). Stwierdzenie jakościowej różnicy w DNA pochodzenia matczynego i płodowego nie stanowi trudności w sytuacjach, kiedy mamy do czynienia z sekwencjami swoistymi wyłącznie dla płci męskiej (jak w przypadku sekwencji DNA charakterystycznych dla chromosomu Y) obecnymi we krwi matki, co jednoznacznie wskazuje na płodowe pochodzenie DNA odziedziczonego po ojcu. Takie podejście – oparte na wykrywaniu jakościowych różnic w pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego i płodowego – szybko znalazło zastosowanie w wykrywaniu u płodu mutacji materiału genetycznego pochodzących od ojca.¹⁷

Szczególnego znaczenia w położnictwie nabrała możliwość nieinwazyjnego wykrywania allelu Rh (D) pochodzenia ojcowskiego, który odziedziczył płód. Jest to szczególnie ważne u par, w których ojciec jest heterozygotą w układzie Rh, natomiast matka jest Rh ujemną homozygotą. Obecnie wykorzystanie pozakomórkowego DNA pochodzenia płodowego w celu określenia wskazań do podawania immunoglobuliny anty-D Rh ujemnym ciężarnym jest strategią szeroko akceptowaną w Europie.¹⁸

Wykrywanie trisomii u płodu na podstawie badania pozakomórkowego DNA

Wziąwszy pod uwagę, że płodowe DNA stanowi zaledwie 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, wykrywanie trisomii płodowych na podstawie jego analizy jest znacznie trudniejsze niż wykrywanie chorób monogenowych pochodzenia ojcowskiego. W przeciwieństwie do wykrywania różnic jakościowych omówionych powyżej diagnostyka trisomii wymaga wykrycia ilościowych różnic w DNA w ciążach dotkniętych trisomią płodu i ciążach prawidłowych, co wynika z faktu, że zarówno matka, jak i płód mają sekwencje DNA swoiste dla chromosomu 21.

Rozróżnienie ciąży, w której płód obciążony jest trisomią, od ciąży prawidłowej jest możliwe dzięki temu, że płód z trisomią 21 ma więcej sekwencji DNA swoistych dla chromosomu 21 niż płód zdrowy. Płód z trisomią 21 zamiast dwóch ma 3 chromosomy 21 pary. Ta niewielka, ale istotna różnica w całkowitej ilości sekwencji DNA swoistych dla chromosmu 21 obecnych we krwi matki jest możliwa do wykrycia. Zakładając, że DNA pochodzenia płodowego stanowi około 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, w próbce krwi ciężarnej, której płód ma trisomię chromosomu 21, powinno być 2,5% więcej sekwencji DNA swoistych dla tego chromosomu niż w przypadku ciężarnej, której płód jest zdrowy. Ta niewielka, ale istotna różnica stanowi podstawę wykrywania trisomii (aneuploidii) opartego na analizie krwi matki. W tym celu wykorzystywane są dwie metody.

Równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA

Jedną z technologii, stosowaną w Stanach Zjednoczonych przez Sequenom (San Diego, Kalifornia) oraz Verinata Health (Redwood City, Kalifornia), jest równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA (massively parallel genomic sequencing, MPGS). W tej metodzie sekwencjonowaniu poddawana jest cała pula pozakomórkowego DNA (pochodzenia matczynego i płodowego). Spośród około 25 milionów sekwencji ocenie ilościowej podlegają te swoiste dla badanych chromosomów (21, 13, 18) i porównywane są z liczbą spodziewaną w przypadku diploidii.

Dotychczas ukazało się kilka doniesień poświęconych próbom ustalenia wartości progowych na podstawie badania wcześniej zdeponowanych próbek krwi ciężarnych. W pracy Chiu i wsp.⁸ opublikowanej w 2011 roku spośród 576 zbadanych próbek osocza w 7% przypadków nie zdołano uzyskać wyniku, jednak wśród pozostałych próbek wykryto wszystkie 86 przypadków trisomii 21. Także w 2011 roku Ehrich i wsp. donieśli o prawidłowym zdiagnozowaniu wszystkich 39 przypadków trisomii obecnych wśród 449 analizowanych próbek osocza ciężarnych.⁷ Nie odnotowano wyników fałszywie dodatnich.